高酰基結冷膠對乳清分離蛋白熱誘導凝膠特性的影響

郭娜，宋苗苗，徐忠東，朱桂蘭，何云昆，余振宇，馬瀅

1(合肥師范學院 生命科學學院，安徽 合肥，230061) 2(合肥工業大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥，230006)

食品中的蛋白質和多糖通過氫鍵、疏水相互作用、范德華力、離子橋聯或共價鍵等形成具有一定三維網絡凝膠結構的連結，形成具有獨特的質地結構和感官特性的凝膠，如豆腐、肉皮凍、果凍[1-4]。蛋白-多糖凝膠的研究擴大了蛋白與膠的使用范圍，為食品的研究和發展開辟了一條新的渠道。蛋白通過受熱變性后結構展開，分子凝聚形成具有三維空間網絡結構的凝膠，蛋白質的兩性結構及凝膠形成的網絡空間也為包載花青素、姜黃素等生物活性物質提供了空間[5-8]。乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)是是乳清經過濃縮精制得到的蛋白質，具有一定營養價值和生物活性，常作為一種食品添加劑來提高食品的凝膠、乳化等功能特性[9]。高酰基結冷膠(high acyl gellan gum，HG)是一種微生物多糖，其形成的凝膠黏彈且柔軟，且受Ca2+等離子影響較小，在乳品及果汁飲料中作為增稠劑和穩定劑使用[10-12]。

乳清蛋白與藍莓果膠通過靜電作用形成的復合物，能夠提高復合物的黏度，并促進蛋白質-藍莓果泥的穩定性[13]。酸化牛奶中酪蛋白與結冷膠結合可以形成連續的凝膠網絡，增強了復合物的質地特性[14]。結冷膠作為復配膠的材料成為食品領域研究的熱點，它可溶解在熱牛奶中，冷卻時形成的網絡結構可以懸浮巧克力牛奶飲料中的可可粉微粒，并能夠穩定奶昔、冰淇凌；在生物醫學方面，通過封裝活性原料用于藥物控制釋放[15-16]。

目前改進凝膠形成方式，開發新型的凝膠產品，受到極大關注。本論文采用乳清分離蛋白(whey protein isolate，WPI)、高酰基結冷膠為材料，制備乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠(WPI-HG)，分析乳清分離蛋白和高酰基結冷膠的相互作用，為拓展乳清分離蛋白和多糖的新型凝膠食品，提高傳統食品的質量，改善食品的加工工藝提供基礎理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高酰基結冷膠(食品級)，美國唐瑞斯食品物料公司；乳清分離蛋白(WPI9410)，美國希里瑪公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722S型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋，HH-2，金壇市瑞爾電器有限公司；HC-3018R冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司；TA-XT plus質構儀，英國Stable Micro Systems公司；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo Nicolet公司；鎢燈絲掃描電子顯微鏡EVO MA15，德國卡爾蔡司股份公司；HAAKE RS6000型流變儀，賽默飛世爾科技公司；UV1800紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合凝膠配制

分別配制200 g/L的乳清分離蛋白溶液和10 g/L的高酰基結冷膠溶液，放置4 ℃條件下過夜備用。按照不同比例配制乳清分離蛋白-高酰基結冷膠溶液(WPI-HG)，使混合液中乳清分離蛋白含量為100 g/L，高酰基結冷膠質量濃度分別為1、1.5、2、2.5、3和4 g/L[分別為WPI+HG(1 g/L)、WPI+HG(1.5 g/L)、WPI+HG(2 g/L)、WPI+HG(2.5 g/L)、WPI+HG(3 g/L)、WPI+HG(4 g/L)]，并在95 ℃加熱0.5 h，冷卻后4 ℃下穩定20 h，形成凝膠。

1.3.2 凝膠強度(gel strength)

采用質構儀分析凝膠強度。使用P 0.5探頭，測前、中、后速度為1 mm/s，感應力為3 g。平行測量3次。

1.3.3 凝膠保水性(water holding capacity)

將樣品在10 000 r/min的離心機中離心15 min，用定性濾紙吸去水分。測定樣品離心前后質量，按公式(1)計算保水率：

(1)

式中：w，凝膠保水率，%；m0，離心前凝膠質量，g；m1，離心后凝膠質量，g。

1.3.4 凝膠透光率(transmittance)

將凝膠放置于1 cm比色管中，測其在620 nm處的透光率。

1.3.5 游離巰基分析

使用Tris-Gly將樣品稀釋至蛋白含量1 mg/mL，8 000 r/min離心15min，取3 mL上清液并加入30 μL DTNB溶液，混勻后反應15 min，測定412nm處吸光度，采用公式(2)計算游離巰基含量：

(2)

式中：δ，游離巰基含量，μmol/g 蛋白；A412，412 nm處的吸光度值；D，稀釋倍數；ρ，蛋白質質量濃度，mg/mL。

1.3.6 流變學性質測定

動態溫度掃描參數設定：溫度變化范圍25～95 ℃，升溫速度為2 ℃/min，保持10 min，降溫速率4 ℃/min，掃描應變為0.01%，掃描頻率為1 Hz，每個樣品做3次平行，使用甲基硅油密封。

1.3.7 傅里葉紅外光譜分析

樣品冷凍干燥后，采用KBr壓片后使用傅里葉紅外光譜儀進行掃描檢測，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.8 掃描電子顯微鏡分析

樣品冷凍干燥后，噴金后采用鎢燈絲電子掃描電鏡觀察。

1.3.9 數據統計與分析

采用軟件Origin 9和SPSS 24對試驗數據進行分析和作圖，數據結果用平均值±標準差來表示，顯著性差異分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行，顯著水平α=0.05。

2 結果與分析

2.1 高酰基結冷膠濃度對混合凝膠形成的影響

制備的乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠圖片如圖1所示。由圖1可知，高酰基結冷膠對混合凝膠的形成具有顯著作用，隨著高酰基結冷膠濃度增大，混合凝膠的外觀結構逐步穩定，在高酰基結冷膠質量濃度3 g/L時，能夠形成穩定的凝膠。

a-WPI+HG(1 g/L);b-WPI+HG(1.5 g/L);c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(2.5 g/L);e-WPI+HG(3 g/L);f-WPI+HG(4 g/L)圖1 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠圖片Fig.1 Visual observation of WPI-HG gels

2.2 高酰基結冷膠質量濃度對混合凝膠硬度的影響

高酰基結冷膠質量濃度對乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠的凝膠強度影響如圖2所示。從圖2可以看出，高酰基結冷膠濃度對凝膠強度的影響顯著。隨著高酰基結冷膠濃度的增加，混合凝膠的強度不斷增強，在4 g/L時,凝膠強度最大，為26.97 g，表明高酰基結冷膠可以提高乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠的凝膠強度。

圖2 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠的強度Fig.2 The gel strength of WPI-HG gels

2.3 高酰基結冷膠濃度對混合凝膠保水性的影響

高酰基結冷膠對混合凝膠的保水性影響如圖3所示。隨著高酰基結冷膠添加量的增加，混合凝膠的保水性明顯上升，其中高酰基結冷膠為2.5 g/L時，保水性最大，為97.41%，這可能是高酰基結冷膠富含大量親水基團，能夠結合大量水分子，且形成的乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠具有一定的網絡，也增加了對水分的束縛作用。這一結果與魔芋葡甘聚糖-咸蛋清蛋白混合凝膠等的凝膠特性一致[17-19]。

圖3 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠的保水性Fig.3 The water holding capacity of WPI-HG gels

2.4 高酰基結冷膠濃度對混合凝膠透光率的影響

高酰基結冷膠對混合凝膠的透過光率影響如圖4所示。

圖4 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠的透光率Fig.4 The transittance of WPI-HG gels

由圖4可以看出，隨著高酰基結冷膠質量濃度的增大，混合凝膠的透光率逐漸降低，這可能是隨著高酰基結冷膠濃度增加，形成的混合凝膠結構更加精密所致。

2.5 游離巰基分析

游離巰基形成的二硫鍵能夠有效增強蛋白質分子間作用力，對凝膠的形成具有重要作用[19]，如圖5所示。

圖5 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠溶液和凝膠的巰基含量Fig.5 Free SH contents of solution and gel

未加熱的混合溶液中巰基含量隨著高酰基結冷膠含量增大而顯著增加(P<0.05)，加熱后的凝膠中巰基含量顯著降低。說明乳清分離蛋白與高酰基結冷膠的結合，阻礙了蛋白質游離巰基間的結合，從而提高了溶液中游離巰基含量；加熱凝膠化過程中游離巰基相結合形成二硫鍵，且隨著高酰基結冷膠含量增加，游離巰基減少，形成的二硫鍵增多，這也與凝膠強度增大結果一致。

2.6 混合凝膠溶液的流變學特性

溫度掃描能夠反應凝膠形成過程中的動態黏彈性變化，儲能模量G′值能夠反應樣品的彈性特性或材料的固體樣性質，耗損模量G″反應樣品的黏性特性[20]。乳清分離蛋白-高酰基結冷膠溶液的溫度掃描結果如圖6所示。

A-WPI溶液；B-WPI+HG(1 g/L)溶液；C-WPI+HG(2 g/L)溶液；D-WPI+HG(2.5 g/L)溶液；E-WPI+HG(3 g/L)溶液；F- WPI+HG(4 g/L)溶液；G- HG(4 g/L)溶液圖6 乳清分離蛋白-高酰基結冷膠溶液的流變性質Fig.6 Temperature scan of composites during thermal gelation

由圖6-A、圖6-B、圖6-C和圖6-G可以看出，溶液的G″均大于G′，說明這幾種溶液主要表現為液體的粘性特性。從圖6-D、圖6-E、圖6-F可以看出，隨著高酰基結冷膠添加量增加，其黏彈性發生明顯變化，在1 000 s后，G′均明顯增大，說明開始形成蛋白凝膠網絡，在2 600 s后，G′顯著上升，且大于G″值，說明此時體系發生相變，表現為固體的彈性特性；添加2.5 g/L高酰基結冷膠發生相變的時間約2 700 s，添加3.0 g/L高酰基結冷膠的體系需要2 830 s，添加4 g/L高酰基結冷膠的體系需要約3 060 s，這說明了高酰基結冷膠能夠促使乳清分離蛋白形成熱凝膠，且隨著含量增加其形成穩定凝膠所需時間增加，也說明提高高酰基結冷膠含量可以提高乳清分離蛋白相轉變溫度。

2.7 混合凝膠微觀結構分析

混合凝膠的顯微結構電鏡圖如圖7所示。可以看出，高酰基結冷膠呈現孔徑較大的網絡結構，且空隙不規則；乳清分離蛋白呈不規則片狀，且有非常明顯的蛋白質顆粒[21]。乳清蛋白-高酰基結冷膠混合凝膠呈現緊密堆疊結構，且隨著高酰基結冷膠濃度的增大，形成孔徑較小的立體網絡結構，這也為負載生物活性物質提供了空間。

a-HG;b-WPI;c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(3 g/L);e-WPI+HG(4 g/L)圖7 顯微結構觀察Fig.7 SEM of the microstructure

2.8 混合凝膠的FTIR分析

a-HG;b-WPI;c-WPI+HG(2 g/L);d-WPI+HG(3 g/L);e-WPI+HG(4 g/L)圖8 紅外光譜分析Fig.8 FTIR spectra

3 結論

本文研究了高酰基結冷膠濃度對乳清分離蛋白-高酰基結冷膠復合凝膠的影響，結果表明混合凝膠的凝膠強度和保水性均優于乳清分離蛋白凝膠，且隨著高酰基結冷膠濃度增大而增大，高酰基結冷膠的濃度為3 g/L時，可形成形態穩定的混合凝膠；濃度為4 g/L時，復合凝膠的凝膠強度最大為26.97 g，保水性最好為97.41%，透光率最低為1.87%。高酰基結冷膠增加了乳清分離蛋白溶液的游離巰基含量，有利于加熱形成二硫鍵，增強凝膠結構，且高酰基結冷膠含量增加可以提高混合凝膠相轉變溫度。紅外光譜結果表明乳清分離蛋白與高酰基結冷膠之間存在分子間作用力，微觀結構表明復合凝膠形成結構均勻的立體網絡結構。