高果糖漿廢液雜糖組分分析及其作為畢赤酵母發酵碳源的資源化利用

劉麗萍,王力,詹曉北,朱莉,鄭志永,4*,高敏杰*

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學 生物工程學院)，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇艾津農化有限責任公司，江蘇 南京，211511) 3(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125) 4(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122)

高果糖漿作為一種新型的甜味劑，近年來得到廣泛應用[1-2]。淀粉經液化、糖化、異構化等步驟得到果葡糖漿，果葡糖漿經果葡分離后，果糖部分作為高果糖漿成品出售或再加工[3]，其余部分雜糖成分復雜，處理困難，增加了企業的負擔。

β-1,3-葡聚寡糖是一類重要的生理活性物質[4-5]，具有抗菌抗腫瘤活性[6-9]。內切β-1,3-葡聚糖酶能隨機斷開葡聚糖中的β-1,3-糖苷鍵，得到功能性寡糖(DP 2-10)[10]。因此，通過內切β-1,3-葡聚糖酶降解β-1,3-葡聚糖是獲取β-1,3-葡聚寡糖的理想方法。

畢赤酵母是近年來極受青睞的一種外源蛋白表達系統[11]。其生長速度快，可達到高密度發酵，這讓碳源成為畢赤酵母發酵過程中消耗量最大的營養元素[12]。本研究室前期研究中分別利用PGAP和PAOX1兩種常規啟動子在畢赤酵母中分泌表達內切β-1,3-葡聚糖酶，并驗證其均能有效水解熱凝膠并獲得功能性β-1,3-葡聚寡糖[13]。PGAP型畢赤酵母多以葡萄糖為碳源，有數據顯示葡萄糖是PGAP型畢赤酵母發酵生產抗菌肽-MP1102的最佳碳源[14]。PAOX1型畢赤酵母多以甘油為碳源，且其外源表達需要甲醇誘導[15]。葡萄糖和甘油市場價格都較昂貴，尋求一種廉價的替代性碳源可大幅度降低畢赤酵母發酵過程中的碳源費用，具有非常大的商業價值。

本研究使用高果糖漿廢液雜糖(下文統稱為雜糖)作為碳源，使用2種不同啟動子(PAOX1、PGAP)調控的畢赤酵母外源表達β-1,3-葡聚糖酶。建立了1種雜糖廢液做碳源進行發酵的資源利用的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 菌株與試劑

內切β-1,3-葡聚糖酶基因BGN13.1 (GenBank:X84085.1)來源于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)。P.pastorisGS115和質粒pPIC9K均為本實驗室保藏。重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a(PAOX1型畢赤酵母)及pGAP9K-BGN13.1a(PGAP型畢赤酵母)均由本實驗室構建[14]。

雜糖，江蘇先卓食品有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、甘油，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

種子培養基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，胰蛋白胨 20。

重組畢赤酵母pGAP9K-BGN13.1a發酵培養基(g/L)：葡萄糖/雜糖40，酵母粉10，蛋白胨40，MgSO45.7，CaSO40.1，K2SO44.8，KH2PO414.3，(NH4)2SO45，PTM14.8 mL/L，pH 6.0。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a發酵培養基(g/L)：甘油/雜糖 40，H3PO420 mL/L，CaSO40.1，K2SO418.2，MgSO4·2H2O 14.9，KOH 4.13，PTM14.8 mL/L，pH 6.0。

1.1.3 儀器與設備

LCS-5000離子色譜儀，美國戴安公司；ultrafle xtreme型MALDI-TOFMS,美國Bmker Daltonics公司；傅里葉紅外光譜儀，美國高力公司；LC-2010A高效液相色譜儀，日本島津公司；7L發酵罐，美國Eppendf NBS公司。

1.2 方法

1.2.1 單糖組成分析

雜糖稀釋2倍后，經5倍醇沉可去除大部分單糖，再對醇沉后的樣品使用石墨化碳固相萃取柱進行分離除去單糖[14]，經薄層層析板檢測，單糖被全部去除。稱取去除單糖后樣品0.005 0 g，加入300 μL 2 mol/L的三氟乙酸(CF3COOH)，100 ℃恒溫酸解12 h，氮吹儀吹干，并加入甲醇操作3次除去CF3COOH，將水解產物用超純水溶解后，定容至25 mL，ICS-5000離子色譜儀進行色譜分析。色譜柱為CarboPac PA20；洗脫方式為梯度洗脫，流動相為A (超純水)，B (250 mmol/L NaOH)，C (1 mol/L NaAc)。

1.2.2 分子量分布及聚合度分析

基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectro metry, MALDI-MS)可以通過測定離子的質荷比(m/z)從而對物質的分子量進行測定。取樣品約為0.1 mg/mL，吸取樣液1.0 μL加到樣品板上，晾干，樣品與基質混合結晶后進行測量。

1.2.3 傅里葉紅外光譜

傅里葉紅外光譜(fourier transform infrared spectrometer, FTIR)是測定物質的官能團結構的質譜手段。樣品與KBr晶體適量混合后充分研磨，制片，在400～4 000 cm-1對測定樣品進行紅外波長掃描。

1.2.4 總糖及主要物質含量測定

采用蒽酮硫酸法測定總糖含量。采用高效液相色譜儀測定葡萄糖、果糖、二糖及三糖含量。色譜柱為Hypersil APS2；流動相為70%乙腈；檢測器為RID檢測器。

1.2.5 培養方法

1.2.5.1 搖瓶培養

重組畢赤酵母pGAP9K-BGN13.1a：按接種量4%(體積分數)將種子液接入裝有50 mL培養基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉速220 r/min，每隔6 h測定OD600、殘余葡萄糖濃度，最終發酵液測酶活。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a：按接種量4%(體積分數)將種子液接入裝有50 mL培養基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉速220 r/min，碳源耗盡后，饑餓培養一段時間，每隔24 h補加1%(v/v)甲醇，每隔6 h測定OD600、殘余甘油或葡萄糖濃度，最終發酵液測酶活。

1.2.5.2 發酵罐培養

重組畢赤酵母PGAP9K-BGN13.1a：將2.7 L 初始培養基置于7 L發酵罐內，滅菌，接種前調節發酵培養基使其在30 ℃、pH 6.0穩定2 h。加入300 m L的種子液。調節通氣量和轉速，維持溶氧量(dissolved oxygen, DO)在10%之上。測定發酵過程中的OD600及葡萄糖含量，待葡萄糖耗盡后，以6 mL/L/H補加500 g/L葡萄糖或雜糖。

重組畢赤酵母pPIC9K-BGN13.1a：將2.7 L 的初始培養基置于7 L發酵罐內，滅菌，接種前調節發酵培養基使其在30 ℃、pH 6.0穩定 2 h。加入300 mL的種子液。當初始碳源耗盡后(DO突然上升，補加少量碳源后DO驟然下降)，開始使用DO-Start程序流加碳源[16]，DO水平維持在20%。當細胞密度達到一定量后，饑餓培養1～2 h以徹底耗盡殘余甘油或葡萄糖，之后開始進行純甲醇誘導。利用甲醇電極在線測量甲醇含量。每隔2～5 h使用氣相色譜法離線測定甲醇含量[17]，維持甲醇質量濃度10 g/L直至發酵結束。

1.2.6 酶活測定

本研究中內切β-1,3-葡聚糖酶活力定義為：以熱凝膠為底物，水解反應1 min生成1μg寡糖所需的酶量為一個酶活單位(U)。

反應體系5 mL，包含1.5 mL 20 g/L熱凝膠懸浮液，2.5 mL 醋酸鈉緩沖液(0.025 mol/L，pH 6.0)，1 mL 畢赤酵母發酵液上清，反應液置于50 ℃水浴2.5 h后沸水浴加熱10 min終止反應。隨后，水解液中寡糖含量采用薄層層析法測定[18]。

1.2.7 蛋白含量測定

使用考馬斯亮藍法測定蛋白含量[19]。

2 結果與分析

2.1 雜糖組分分析

2.1.1 單糖組成、分子量及聚合度分析

對二糖以上部分進行單糖組成分析，結果如圖1，經標準糖對比分析，證明雜糖二糖以上部分是由葡萄糖單體組成的聚合物。

1-巖藻糖;2-鼠李糖;3-阿拉伯糖;4-半乳糖；5-葡萄糖；6-木糖；7-甘露糖;8-果糖圖1 單糖祖成分析Fig.1 The monosaccharide compositions analysis

利用MALDI-MS表征手段對雜糖的分子量進行檢測，結果如圖2。

圖2 雜糖的MALDI-MS質譜鑒定Fig.2 The MAOLDI-MS identification of the mixedcarbohydrate

線性葡聚糖的質荷比(m/z)=162×n+18+39(MrK) (n表示聚合度)[20]；結合單糖組成分析的結果(圖2僅顯示二糖以上質譜結果)，對樣品糖進行MALDI-MS 圖譜分析，目標核質比數據顯示雜糖是含有 1～16 個聚合度的線性多糖。

2.1.2 傅里葉紅外光譜

使用紅外光譜法驗證雜糖立體構型是否發生改變，如圖3所示， 在3 200～3 600 cm-1處的伸縮振動峰是—OH的特征吸收峰，2 915～2 940 cm-1處的伸縮振動峰吸收峰是—CH的特征吸收峰[21]。在840 cm-1處是α-型糖苷鍵的特征吸收峰。這些結果表明，雜糖中寡糖均是α-型葡寡糖[22]。

圖3 雜糖的FTIR分析Fig.3 The FTIR spectra of the mixed carbohydrate

2.1.3 總糖及主要物質含量

結合以上分析，雜糖的寡糖部分是聚合度2～16的α-型線性葡聚糖，單糖部分包括葡萄糖和果糖。采用蒽酮硫酸法測總糖，測得雜糖的總糖含量為802.3 g/L。利用HPLC法測定雜糖中單糖、二糖及三糖含量，結果：葡萄糖480 g/L，果糖92 g/L，麥芽糖103.6 g/L，麥芽三糖36.8 g/L。理論上其可作為優質的生物發酵的可替代碳源。

2.2 PAOX1型畢赤酵母發酵培養

2.2.1 發酵初始碳源含量

PAOX1型畢赤酵母外源表達過程需要甲醇誘導，是應用最廣泛的畢赤酵母之一。發酵初始碳源含量對發酵過程有著重要的影響。初始碳源含量過低，發酵液中營養成分不足，菌株生長緩慢，過高可能會對菌株生長起到抑制作用[23]。選取3個碳源梯度，如圖4所示，初始甘油為20和60 g/L時，菌株生長均被不同程度抑制。相同條件下使用雜糖做碳源時高濃度抑制作用不明顯，但最大生物量與甘油相比低21%左右。

a-甘油作碳源;b-雜糖作碳源圖4 不同初始碳源含量對PAOX1型畢赤酵母生長效果的影響Fig.4 Effects of different initial carbon source contents oncell growth of P. pastoris PAOX1

2.2.2 7 L發酵罐發酵培養

在7 L發酵罐水平進行放大培養,如圖5所示。

a-甘油作碳源;b-雜糖作碳源圖5 7 L發酵罐水平PAOX1型畢赤酵母發酵過程圖Fig.5 The batch profiles of P. pastoris PAOX1in 7 L bioreactor

以雜糖為碳源的PAOX1型畢赤酵母發酵過程與甘油有較大區別。在生物量方面，雜糖做碳源時最大生物量為59.1 g/L，比甘油的82 g/L低20%左右。進入誘導期時間比甘油組晚8 h，且在誘導期幾乎不再生長。對于PAOX1型畢赤酵母，甘油作碳源時菌株生長效果往往優于葡萄糖,而雜糖的主要成分為葡萄糖，所以使用雜糖作碳源在PAOX1型畢赤酵母的菌株積累方面與甘油相比不占優勢；在誘導期，雜糖為碳源時最高酶活性為157.29 U/mL，比甘油的199.2 U/mL低21%左右，葡萄糖以及低聚寡糖等對AOX1啟動子具有強烈抑制作用[12],盡管經過饑餓培養階段，培養基中的葡萄糖已被耗盡，但不排除雜糖中的寡糖對產酶的抑制作用。但考慮到雜糖成本遠低于甘油，所以雜糖仍可作為PAOX1型畢赤酵母可選擇的生長期碳源。

2.3 PGAP型畢赤酵母發酵培養

2.3.1 發酵初始碳源含量

GAP啟動子是畢赤酵母表達系統中AOX1啟動子的常用替代啟動子之一，其表達過程不需要甲醇誘導，可以有效利用葡萄糖供菌體生長以及外源蛋白表達。

如圖6所示，初始葡萄糖為40和60 g/L時生長效果較好，但兩者相差不大。出于經濟性考慮，應選取40 g/L的初始葡萄糖含量進行發酵。相同條件下使用雜糖做碳源時生長效果與葡萄糖相當，兩者呈現出相似的生長規律。由此可見，雜糖可被PGAP型畢赤酵母有效利用，供菌體生長。

a-葡萄糖作碳源;b-雜糖作碳源圖6 不同初始碳源含量PGAP型畢赤酵母生長效果的影響Fig.6 Effects of different initial carbon source contentson cell growth of P3 pastoris PGAP

2.3.2 7 L發酵罐發酵培養

在7 L發酵罐水平進行放大培養。如圖7所示，以雜糖為碳源的PGAP型畢赤酵母發酵效果與葡萄糖相當，最大生物量分別達到69.3和71.6 g/L，最高酶活分別為180.2和176.5 U/mL。說明本實驗所用雜糖可以作為PGAP型畢赤酵母的優質替代性碳源生產內切β-1,3葡聚糖酶。

a-葡萄糖作碳源;b-雜糖作碳源圖7 7 L發酵罐水平PGAP型畢赤酵母發酵過程圖Fig.7 The batch profiles of P. pastoris PGAP in 7 Lbioreactor

3 結論

雜糖為碳源代替葡萄糖或甘油利用2種不同啟動子調控的畢赤酵母外源表達內切β-1,3葡聚糖酶。雜糖成分為葡萄糖和果糖以及聚合度為2～16的線性葡聚糖，主要為葡萄糖480 g/L、果糖92 g/L、麥芽糖103.6 g/L、麥芽三糖36.8 g/L、總糖含量為802.3 g/L。以40 g/L的初始碳源質量濃度對2株畢赤酵母進行發酵培養，在7 L發酵罐水平，雜糖與葡萄糖在做PGAP型畢赤酵母碳源時發酵效果相當，其可以作為優質替代性碳源代替葡萄糖；在此條件下，使用雜糖作替代碳源可節省約37.1元碳源成本。對于PAOX1型畢赤酵母，雜糖做碳源細胞密度和酶活性與甘油相比均有所下降，最大生物量分別為59.1和82.0 g/L，最高酶活性分別為157.29和199.2 U/mL，在此條件下，使用雜糖作替代碳源可節省約17.7元碳源成本，但雜糖發酵效果較差這一現象還有待進一步展開相關研究，以期得到雜糖做PAOX1型畢赤酵母替代性碳源更好的方法。