PD-L1表達抑制劑的篩選及其抗腫瘤活性

景 磊，趙苗苗，姜 博，李玉銀，刁愛坡

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

腫瘤細胞可以利用免疫檢驗點(immune checkpoint)調節 T淋巴細胞的功能[1]，從而逃逸免疫系統對腫瘤細胞的識別與殺傷作用．機體免疫細胞的激活與抑制是通過共刺激信號進行調節，其中程序性死亡蛋白 1(PD-1)與其配體蛋白 PD-L1作為一個主要的免疫檢驗點，是一個負調節性信號途徑．當 PD-1/PD-L1信號激活后，抑制T淋巴細胞的活化和細胞因子的分泌，使機體免疫應答受到抑制[2–3]．因此，阻斷PD-1/PD-L1信號的傳遞是激活機體抗腫瘤免疫應答的有效途徑[4]．

目前，靶向 PD-1/PD-L1免疫檢驗點的抗體類阻斷劑已經在超過 1000例臨床試驗中被評估并取得了一定的療效[5]，但是，大約 1/3的患者在治療過程中會出現乏力、頭昏、全身肌肉酸痛等現象，部分患者甚至會出現嚴重的免疫相關不良反應[6–8]．與抗體類阻斷劑相比，小分子多肽類藥物則沒有抗體的局限性，如減弱 Fc–免疫效應功能，同時可以避免與免疫相關的不良反應[9]．目前已有許多非抗體類 PD-1/PD-L1信號通路抑制劑被報道，如 PD-1蛋白表面肽段的突變體和 D–型短肽等[10-11]，但是需要進一步的臨床評估．小分子化合物具有高穩定性、易穿透性、低成本性和方便口服的特性，具有廣闊的發展空間，由于 PD-1/PD-L1相互作用結構區域具有高度疏水的特性，致使靶向于該位點的小分子化合物阻斷劑的發展遠遠滯后于抗體阻斷劑的發展．目前只有百時美施貴寶公司設計開發的一類小分子化合物可以直接作用于PD-1/PD-L1結合位點，如BMS-1、BMS-202等[12-13]．總之，這些阻斷劑主要通過競爭性阻斷PD-1/PD-L1蛋白間的結合，進而解除PD-1/PD-L1介導的免疫抑制信號．

PD-L1蛋白是由 290個氨基酸組成的可被糖基化修飾的 I型跨膜蛋白，在多種惡性實體瘤中高表達，如非小細胞肺癌、三陰性乳腺癌、頭頸癌、黑色素瘤等[14]，其蛋白表達水平因腫瘤類型不同而不同．腫瘤細胞逃逸免疫細胞與PD-L1蛋白表達緊密相連[15–16].盡管 PD-L1在腫瘤免疫中具有重要作用，但是對如何調控 PD-L1蛋白表達，進而促進抗腫瘤免疫活性研究較少，因此，尋找抑制腫瘤細胞PD-L1蛋白表達的小分子化合物具有重要研究意義．本文擬利用熒光素報告基因系統篩選抑制 PD-L1啟動子活性的化合物，通過 RT-PCR、Western blot、細胞共培養體系、ELISA、小鼠成瘤等方法研究其調控 PD-L1蛋白表達和抗腫瘤免疫活性的作用．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細胞、質粒與實驗動物

大腸桿菌(E.coli)Top10購自Invirogen公司；子宮頸癌細胞 HeLa、乳腺癌細胞 MDA-MB-231、小鼠黑色素瘤細胞 B16購自北京協和醫學院細胞資源中心；PD-L1啟動子熒光素報告基因質粒 pGL4-hPDL1 本實驗室構建[17]，pCMV-β-Gal購自 Thermo Scientific公司．C57BL/6小鼠(許可證 11400500028097)購自中國食品藥品檢定研究院．

1.1.2 主要試劑

DNA marker、PageRulerTMPrestained Protein Ladder、LipofectamineTM2000，Thermo Scientific 公司；細胞完全培養基 DMEM、RPMI 1640、胰酶，GIBIO 公司；青霉素、鏈霉素、L-Glutamine、熒光素、ONPG溶液，碧云天生物技術有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；小分子化合物庫(L1300 Selleck FDA Approved Drug Library)，Selleck公司；hPD-L1抗體(EPR19759)、mPD-L1(EPR20529)，Abcam 公司；β-actin、Goat anti-rabbit IgG-HRP、Goat anti-mouse IgG-HRP，天津三箭生物技術有限公司；硫酸長春新堿(HY-N0488)，MCE公司；Mouse IL-2 ELISA kit、mouse γ-IFN ELISA kit，科諾迪生物技術有限公司．

1.2 方法

1.2.1 PD-L1表達抑制劑篩選

待HeLa細胞于3cm培養皿中長至70%～80%時，共轉染 5μg pGL4-hPD-L1 和 1μg pCMV-β-Gal質粒，8h后換成新鮮培養基繼續培養 12h，然后以15000個/孔的細胞密度鋪 96孔板，24h后用 3%FBS的 DMEM 培養基稀釋小分子化合物(終濃度1μmol/L)和等量 DMSO(作為對照)處理 HeLa細胞24h．棄培養基，每孔加入 100μL細胞裂解液，冰上裂解30min，每10min振蕩一次．吸取40μL裂解樣品于 96孔白板中，加入熒光素酶底物溶液 105μL，測定熒光素酶活性值；同時吸取 40μL裂解樣品于96孔板，加入48μL Buffer Z(使用前每10mL buffer Z 緩沖液 36μL β–巰基乙醇)，再迅速加入 16μL 6mg/mL的 ONPG溶液，待有一個孔的溶液變黃時，測定 420nm 波長下的吸光度(β–半乳糖苷酶活性值)．

1.2.2 RT-PCR

分別用 DMSO和 10nmol/L硫酸長春新堿(vincristine sulfate，VCR)預處理 MDA-MB-231 細胞24h，Trizol試劑提取 Total RNA，并進行逆轉錄及PCR反應，依照說明書的方法進行操作，其中 RT反應條件：50℃ cDNA 合成 30min，85℃孵育5min．PCR反應條件：94℃預變性5min；變性30s，55℃退火 30s，72℃延伸 1min，29個循環；72℃延伸 5min．PD-L1和 β-actin引物序列分別為：PD-L1上游 5′-GACCTATATGTGGTAGAGTATGG-3′，下游5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′；β-actin 上 游 5′-GGCATTGACTTTCACAG-3′，下游 5′-GGCATTGA CTTTCACAG-3′．用 2μg/mL PHA 誘導 Jurkat細胞48h后，按照上述方法提取 Total RNA并 RT-PCR，PD-1引物序列為：PD-1上游 5′-CCAGGATGGT TCTTAGACTCC-3′，下游 5′-GGCTGGCCTGGGTGA GGGGCTG-3′．

1.2.3 MTT法檢測細胞活力

96孔板每孔接種 8000個細胞，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度梯度的 VCR，每個濃度梯度設置3個復孔．VCR 分別處理 24、48、72h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃細胞培養箱繼續培養4h，棄孔板內液體，每孔加入 200μL DMSO，水平振蕩器上振蕩10min，酶標儀測定490nm處吸光度．

1.2.4 MTT法檢測Jurkat細胞對腫瘤細胞殺傷活性

DMSO和10nmol/L VCR分別處理MDA-MB-231細胞 48h，再分別接種于 96孔板，5000個/孔，設置 4個重復．待細胞貼壁后按照 E﹕T(Jurkat﹕MDA-MB-231)比為 4﹕1和 8﹕1的比例加入活化的 Jurkat細胞[18](2μg/mL PHA 預處理 Jurkat細胞48h)共培養 24h．每孔加入 20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃細胞培養箱繼續培養 4h，不吸出培養基直接每孔加入甲瓚裂解液[19-20]100μL，置于37℃培養箱中孵育 8h，水平振蕩器上振蕩 10min，酶標儀測定 570nm 處吸光度(A)．腫瘤殺傷率按照式(2)計算．

1.2.5 ELISA法檢測小鼠血清細胞因子含量

用肝素抗凝管收集 C57BL/6小鼠血液，1000r/min離心10min，取上清液．按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清中 IL-2和 γ-IFN的含量．

1.2.6 小鼠成瘤實驗

21只 6～8周齡的雌性 C57BL/6小鼠購自中國食品藥品檢定研究院，取培養至對數生長期的小鼠黑色素瘤細胞 B16用生理鹽水配制成為 1×107mL-1的細胞懸浮液，每只小鼠右前肢腋下接種 100μL細胞懸浮液．當觀察到腫瘤出現后隨機分為 3組，每組 7只，開始給藥．給藥濃度分別為 0.5mg/kg和1.5mg/kg，對照組給予等量生理鹽水，每隔 1d腹腔注射給藥一次，同時用游標卡尺測量腫瘤的長徑(mm)和短徑(mm)，按照式(3)計算腫瘤體積．在第13天處死小鼠，眼球取血，用于檢測小鼠血液細胞因子分泌情況．同時剝離腫瘤，凍存于-80℃冰箱中，用于后續免疫印跡實驗．

1.3 統計學分析

應用 SPSS軟件進行數據的整理分析，采用 t檢驗進行組間比較，檢驗結果P＜0.05表示差異有統計學意義，*、**和***分別表示與對照組比較 P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001．

2 結果與分析

2.1 PD-L1表達抑制劑篩選

利用實驗室保存的 PD-L1啟動子熒光素報告基因質粒pGL4-hPD-L1和β–半乳糖苷酶報告基因質粒pCMV-β-Gal共轉染 HeLa細胞，設置藥物篩選濃度為 1μmol/L，篩選抑制 PD-L1啟動子活性的小分子化合物，結果如圖1所示．

圖1 抑制PD-L1啟動子活性小分子化合物的篩選Fig. 1 Screening of 311 small molecule compounds downregulating the activity of PD-L1 promoter

篩選了化合物庫中 311種小分子化合物(圖1(a))，其中硫酸長春新堿(VCR)具有濃度梯度依賴性抑制PD-L1啟動子活性效果(圖1(b))，在VCR濃度1μmol/L時抑制率約為60%．

2.2 VCR抑制MDA-MB-231細胞PD-L1蛋白表達

乳腺癌細胞系MDA-MB-231能夠高表達PD-L1蛋白[21]．首先通過 MTT法檢測 VCR對 MDA-MB-231細胞活力的影響，結果如圖 2(a)所示．當藥物處理濃度小于10nmol/L時，VCR對MDA-MB-231細胞活力影響較小．

圖2 VCR抑制MDA-MB-231細胞中PD-L1表達Fig. 2 VCR suppressing PD-L1 expression in MDA-MB-231 cells

用10nmol/L VCR處理MDA-MB-231細胞24h后提取全 RNA，RT-PCR檢測 PD-L1mRNA水平變化，結果如圖2(b)所示，VCR下調MDA-MB-231細胞 PD-L1mRNA表達水平．不同濃度的 VCR處理MDA-MB-231細胞 48h后收集細胞，制備蛋白樣品，免疫印跡實驗(Western blot)檢測 PD-L1蛋白水平變化．結果(圖 2(c))顯示，隨著 VCR藥物濃度增加，PD-L1蛋白水平呈濃度依賴性減少．以上結果表明，VCR通過下調 MDA-MB-231細胞 PD-L1基因的轉錄活性，進而抑制細胞PD-L1蛋白表達．

2.3 VCR增強 JurkatT細胞對 MDA-MB-231細胞的殺傷能力

植物血凝素(phytohemagglutination，PHA)能夠誘導人 T淋巴細胞株 Jurkat細胞表達 PD-1[22]．用2μg/mL PHA誘導Jurkat細胞48h后，RT-PCR方法檢測 Jurkat細胞 PD-1表達變化，結果如圖 3(a)所示．與無 PHA 誘導相比，2μg/mL PHA 處理促進Jurkat細胞PD-1mRNA水平明顯升高．

通過 Jurkat細胞和 MDA-MB-231細胞共培養，MTT法檢測VCR處理MDA-MB-231后Jurkat細胞對其殺傷能力的影響，結果如圖 3(b)所示．在 E﹕T比為 4﹕1和 8﹕1時，與 DMSO 對照組相比，用10nmol/L VCR處理組均能夠增加 Jurkat細胞對MDA-MB-231細胞的殺傷率．研究結果顯示，當用VCR抑制 MDA-MB-231細胞 PD-L1蛋白表達后，阻斷了由 PD-1/PD-L1信號介導的免疫抑制，從而增強Jurkat細胞對MDA-MB-231細胞殺傷作用．

圖3VCR增強 Jurkat細胞對 MDA-MB-231細胞的殺傷作用Fig. 3 VCRenhancing the killing activity of Jurkat cells to MDA-MB-231cells

2.4 VCR抑制B16細胞PD-L1蛋白表達

由以上結果可知，VCR通過抑制 PD-L1啟動子活性下調MDA-MB-231細胞PD-L1蛋白表達，然而VCR在體內是否通過抑制PD-L1表達而增強機體的抗腫瘤活性有待深入了解．由于 MDA-MB-231細胞在免疫系統正常的小鼠體內無法成瘤，而 B16細胞C57BL/6小鼠成瘤模型在PD-1/PD-L1抑制劑檢測方面有著廣泛的應用[23-24]，因此選擇小鼠 B16細胞研究VCR對其在小鼠體內成瘤情況以及調控機體的抗腫瘤活性．首先，用不同濃度的 VCR處理 B16細胞48h后，收集蛋白樣，Western blot檢測 PD-L1蛋白表達情況，結果如圖 4所示．VCR化合物濃度大于40nmol/L時，VCR處理 B16細胞中 PD-L1蛋白水平明顯降低．以上結果表明，VCR能夠下調 B16細胞PD-L1蛋白表達水平．

圖4 VCR抑制B16細胞PD-L1蛋白表達Fig. 4 VCR inhibiting the expression of PD-L1 in B16 cells

2.5 VCR抑制B16在C57BL/6小鼠體內成瘤

將 B16細胞接種到 C57BL/6小鼠皮下成瘤，在接種第5天分別用0、0.5、1.5mg/kg VCR腹腔給藥，每隔1d給藥一次，共給藥4次；同時測量腫瘤大小，第 13天處死小鼠前最后一次測量腫瘤大小，結果如圖5所示．

與對照組相比，隨著腫瘤生長時間的延長，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR給藥組的腫瘤生長受到顯著抑制，其中 1.5mg/kg組腫瘤生長抑制更加明顯．第 13天時 0.5mg/kg 和 1.5mg/kg VCR給藥組的腫瘤體積和質量也明顯小于對照組．對照組和0.5mg/kg組小鼠體重無差異，1.5mg/kg組體質量有略微下降，其中一只死亡．以上結果表明，VCR能夠抑制 B16細胞在 C57BL/6小鼠體內成瘤，高劑量VCR會對小鼠產生毒副作用．

2.6 VCR調控C57BL/6小鼠抗腫瘤免疫活性

每組選取上述 5個黑色素瘤腫瘤組織通過研磨裂解制備樣品，Western blot檢測腫瘤組織中 PD-L1蛋白水平，結果如圖 6(a)所示，與對照組相比，0.5mg/kg 和1.5mg/kg VCR給藥組腫瘤組織中PDL1蛋白水平呈整體下降趨勢．參與抗腫瘤免疫應答的 T細胞有很多種，其中細胞毒性 T細胞(Tc)和輔助性 T細胞(Th)在增強抗腫瘤免疫應答過程中發揮著主要作用，而Th細胞可以產生IL-2、γ-IFN等細胞因子增強機體免疫活性[25-26]．通過 ELISA 方法檢測C57BL/6小鼠血清中細胞因子IL-2和γ-IFN含量變化，結果(圖 6(b)和 6(c))顯示，與對照相比，0.5mg/kg和 1.5mg/kg組均能夠上調血清中細胞因子 IL-2和 γ-IFN水平．以上結果表明，VCR通過抑制B16細胞中PD-L1蛋白表達阻斷PD-1/PD-L1信號，增加T細胞分泌IL-2和γ-IFN，從而增加機體免疫系統對腫瘤細胞的殺傷作用．

3 討 論

VCR是從長春花中提取的一種生物堿，其作用于細胞微管蛋白，抑制微管聚合，從而干擾腫瘤細胞分裂[27]．臨床上常作為抗腫瘤藥物，主要應用于治療急性淋巴細胞白血病(ALL)、神經母細胞瘤[28]等，但由于其對神經系統和注射局部正常組織刺激性大，限制其臨床應用[29]．目前臨床上通常采用聯合用藥的方法降低 VCR的劑量，從而降低 VCR的毒副作用[30]，如無毒劑量的維拉帕米與低濃度 VCR聯合使用可使其抑制胃癌細胞增殖作用增強 2.7～7.5倍[31]，VCR和甲基潑尼松龍聯合對 ALL效果比單用 VCR效果顯著[32]．本文研究顯示：10nmol/L的VCR在體外下調乳腺癌 MDA-MB-231細胞 PD-L1mRNA水平和蛋白水平；VCR在體內抑制 B16細胞成瘤和PD-L1蛋白表達，并且上調 C57BL/6小鼠血清中細胞因子 IL-2和 γ-IFN的含量．這些研究結果表明，VCR可以通過抑制腫瘤組織細胞中PD-L1蛋白表達調控PD-1/PD-L1信號，并解除對腫瘤浸潤性T細胞的抑制狀態，從而增強 T細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷作用．

目前，免疫療法聯合用藥越來越受到人們的關注，已有多種聯合用藥方案應用于臨床并取得了令人意外的療效[33]，如 keytruda/pemetrexed/carboplatin三藥聯合已經成為轉移性非鱗狀 NSCLC的一線治療藥物[34]．三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)發病率約占乳腺癌的 15%，是乳腺癌的一種獨立臨床病理類型，具有預后差、侵襲能力強等特點[35]．由于其具有獨特的生物學特征，現有的內分泌治療和分子靶向治療等治療方式不能滿足 TNBC患者治療的臨床需求[36]．研究發現黑色素瘤相關抗原3(melanoma associated antigen 3，MAGEA3)在多達40%的 TNBC患者中特異性表達，可以作為腫瘤疫苗靶點用于 TNBC患者的臨床治療[37]．本文發現VCR在納摩爾水平就可以抑制乳腺癌細胞 MDAMB-231 PD-L1蛋白表達，同時也發現高劑量 VCR給藥會對小鼠有毒副作用．因此，適合劑量 VCR與MAGEA3腫瘤疫苗聯合使用，有望改善單藥治療在臨床應用上的局限性，使患者獲得更大的治療效果．