HIGS-SsCCS 轉基因擬南芥的菌核病抗性鑒定

柴亞茹，丁一娟，周思鈺，楊文靜，閆寶琴，遠俊虎，錢偉

（西南大學農學與生物科技學院，重慶 400715）

0 引言

【研究意義】核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）為隸屬于子囊菌門、核盤菌屬的一種植物病原真菌，其寄主廣泛，可以侵染包括油菜、馬鈴薯、棉花、番茄、大豆等多種重要的農作物在內的400 多種植物[1-3]，造成巨大的作物產量損失。目前對菌核病的防治主要依靠化學殺菌劑，但該方法成本高、影響環境，且易產生耐藥菌株導致防治效果不理想，因此創建高抗材料是菌核病防治的關鍵。近年來，寄主誘導的基因沉默技術（host-induced gene silencing，HIGS）在研究病原菌基因功能及增強寄主抗病性中起著越來越重要的作用[4]。因此，利用 HIGS 技術在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中沉默核盤菌銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase，SsCCS），獲得抗性穩定持久的材料，可為油菜等作物的抗菌核病育種提供新方法，并為安全防控菌核病提供重要靶標基因。【前人研究進展】目前創制菌核病抗病材料的方法主要包括以下幾種：一種方法是通過雜交、回交等傳統選育方式培育抗病品種，另一種方法是通過在植物體內過表達抗病相關基因，從而增強植株的抗病性，以及通過細胞工程及誘變育種的方式進行抗病品種的培育[5]。但抗病遺傳資源缺乏，以及核盤菌致病機理復雜，相關的抗病位點開發以及抗病分子機制的研究受到限制，導致菌核病抗病育種進程緩慢。近年來在真菌、細菌、病毒、植物、線蟲、人中都發現基因沉默（RNAi）現象[6-8]，RNAi 是由雙鏈RNA（dsRNA）介導的、由特定酶參與的特異性基因沉默，它在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達。前人研究發現利用攜帶特定基因片段的不同病毒載體侵染本氏煙，可以導致特定靶基因的沉默，進而發展了病毒介導的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術[4]。寄主誘導的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）技術是VIGS 的進一步發展[9]，HIGS 通常以病原菌生長發育、致病過程中的關鍵基因作為靶標基因，通過將靶標基因的反義發夾結構或RNAi 結構轉染到寄主植物，產生靶標基因的dsRNA，并經植物細胞本身的Dicer 核酸酶加工形成19—25 nt 的siRNA。在病原菌侵染植物時，siRNA 通過囊泡從植物體運輸到病原菌，干擾病原菌靶基因的表達，從而減弱其致病能力，間接增強寄主植物的抗病性[10]。NOWARA 等[11]發現在大麥中表達大麥白粉病菌（Blumeria graminis）葡聚糖轉移酶效應子的RNA 干擾分子會提高其抗性水平，據此首次提出了HIGS 的概念。此后，該技術被廣泛應用在各種作物與多種真菌互作研究中，如小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）[12]、禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）[13]以及黃萎病菌[14]。最近，有研究人員利用HIGS 技術在煙草中表達核盤菌Sschs的RNAi 結構，發現轉基因T1代煙草的菌核病抗性顯著增強[15]。但是利用HIGS 技術是否能獲得穩定持久可遺傳的菌核病抗性還有待研究，且該技術在十字花科植物抗菌核病的研究還未見報道。研究表明，當病原菌入侵宿主時，寄主植物最早啟動的免疫防御依賴于活性氧（ROS）迸發[16]。過量的ROS 不僅會對植物細胞，也會對病原菌造成細胞膜DNA 及蛋白質等的損害[17-18]。超氧化物歧化酶（SOD）是清除活性氧爆發的第一步，將歧化為H2O2和氧氣，進而生物體將H2O2分解為無毒的水[19]。SOD 按其結合的金屬離子，可分為Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD 以及Ni-SOD 4 種[20-21]，其中CuZn-SOD 主要存在于細胞質以及線粒體內外膜之間作為氧化物清除劑[22]。相關研究表明，核盤菌中編碼CuZn-SOD 的基因突變后，核盤菌抗氧化能力減弱，致病力顯著下降[19,23]。銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶是目前鑒定的分子量最大的一類銅伴侶蛋白質，可通過N 端結構域傳遞銅離子至CuZn-SOD 的銅離子結合位點，從而激活CuZn-SOD的酶活性[24-25]。LI 等[26]研究發現在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染條件下，水稻銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶CCSD缺失突變體導致CuZn-SOD酶活性顯著降低，水稻抗病性減弱。因此，銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因對于生物體CuZn-SOD 的酶活性激活及ROS 的清除能力至關重要。【本研究切入點】盡管現有菌核病抗病育種取得了一定進展，但嚴重依賴抗病材料及抗病基因的挖掘，進展緩慢，因而亟需發展新的抗病育種技術。本研究選擇核盤菌銅鋅超氧化物歧化酶銅伴侶基因SsCCS作為靶基因，構建該基因的HIGS 載體并轉化擬南芥，通過菌核病抗性鑒定，驗證HIGS 技術應用于寄主菌核病抗性改良的可能性。【擬解決的關鍵問題】利用HIGS技術在擬南芥中表達特異靶向核盤菌SsCCS的dsRNA，創建持久高抗菌核病的轉基因株系，為今后將HIGS 技術應用到油菜等十字花科植物的菌核病抗性育種中打下基礎，并為安全防治菌核病提供靶基因。

1 材料與方法

試驗于2017 年10 月至2019 年3 月在西南大學農學與生物科技學院完成。

1.1 供試材料

本試驗所用擬南芥哥倫比亞生態野生型Col-0，核盤菌菌株1980 均由重慶市油菜工程技術研究中心提供。基因沉默表達載體pCIT 由西南大學植物保護學院余洋老師惠贈，擬南芥紅光表達載體pBin35SRed3 由華中農業大學張椿雨教授惠贈[27]，用于基因克隆的T 載體p GEM?-T Easy Vector 購于Promega 公司（美國）。大腸桿菌菌株DH5α，農桿菌菌株GV3101 購于北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech）。

核盤菌菌株1980 保存于馬鈴薯培養基（PDA）中。

1.2 生物信息學分析

從核盤菌基因組數據庫（http://www.broadinstitute org/ annotation/genome/Scleraotinia sclerotiorum/Uenomeslndex html）提取SsCCS的編碼序列及氨基酸序列，通過ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）預測SsCCS 蛋白的分子量及等電點（PI），將其氨基酸序列在NCBI 上進行同源比對（Blast），利用 MEGA6.0構建SsCCS的系統發育樹。

1.3 HIGS 沉默表達載體的構建

利用BioEdit 軟件將SsCCS與核盤菌以及擬南芥基因組序列進行比對，選擇SsCCS的特異片段作為RNA 干擾片段，利用Primer Premier 5 設計特異引物，并引入相應的酶切位點（表1）。以核盤菌野生菌株1980 的cDNA 為模板，以SsCCS-SF/SsCCS-SR 及SsCCS-AF/SsCCS-AR 分別進行擴增，并將膠回收的目的片段連接到pGEMT-Easy 載體，轉化至大腸桿菌DH5α，挑選陽性單克隆送Invitrogen 公司測序。提取測序正確T 克隆質粒T-SsCCS-S 及T-SsCCS-A，首先采用限制性內切酶EcoRI/EcoRV 雙酶切T-SsCCS-S，將該正向片段連入pCIT，獲得中間載體p-ccs-1。隨后采用PstI/BamHI 雙酶切T-SsCCS-A，將該片段反向連入p-ccs-1，獲得SsCCS的干擾載體p-ccs。隨后，用EcoRI 和XhoI 分別雙酶切p-ccs 及植物轉化載體pBin35SRed3 的質粒，將p-ccs 載體中的主體結構“正向序列-內含子-反向序列”連接到pBin35SRed3 的CaMV35S 啟動子與Nos 終止子之間，獲得沉默SsCCS的HIGS 載體R-ccs。將重組質粒R-ccs 轉化至農桿菌GV3101，挑選陽性單克隆的菌液加入50%的甘油1﹕1 等體積混合于2 mL 離心管中，保存于-80℃。

表1 SsCCS 載體構建所用引物序列Table 1 Sequence information of primers used for vector construction of SsCCS

1.4 擬南芥的遺傳轉化及鑒定

將擬南芥哥倫比亞生態型（Col-0）直播于營養土中，在22℃，16 h 光照、22℃，8 h 黑暗培養箱中生長40 d 左右，去掉已經結莢的和開放的花朵后，采用農桿菌介導的浸花序法[28]將重組質粒轉化擬南芥。收獲侵染后的T0代擬南芥種子，選擇發紅色熒光種子進行播種，獲得T1代轉基因擬南芥。選取轉基因擬南芥幼葉于研缽中，用液氮進行研磨，用CTAB 法提取DNA，利用引物RVF/RVR（表1）對T1代轉基因株系進行PCR 鑒定，篩選陽性植株。

1.5 菌核病抗性鑒定

在PDA 平板上活化核盤菌野生型菌株1980，用直徑2 mm 的打孔器取生長2 d 的邊緣菌絲用于接種。將2 mm 的菌絲塊接種于擬南芥葉片上，帶菌面緊貼葉片。接種后，將接種葉片置于可控溫控濕環境內，溫度設置為22℃，相對濕度保持在85%左右。接種24 h 后統計病斑的長徑和短徑，利用公式S=π×a×b/4計算病斑面積（其中a 代表病斑長軸長度，b 代表病斑短軸長度）[29]，并利用SAS 軟件進行統計學分析。試驗重復3 次，每次3—5 片葉片。

1.6 H2O2檢測

聯苯胺（3,3'-diaminobenz-idine-HCl，DAB）染色檢測法參照GUAN 等的方法[30]。將接種6、12、24 h后的擬南芥葉片立即置于1 mg·mL-1的DAB 溶液（pH 3.8）中，染色6 h 后于沸騰的95%乙醇中脫色10 min，冷卻后，于無水乙醇中室溫保存并拍照。

1.7 qRT-PCR

取T3代純合轉基因擬南芥接種核盤菌后6 h 的葉片及病斑組織，采用TRIzol?法提取總RNA，采用Bio RAD 的i ScriptTMcDNA Synthesis Kit 試劑盒將RNA樣品反轉錄成cDNA。采用Bio RAD 的 i TaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 試劑盒，利用引物RT-SsccsF/RT-SsccsR（表1），在CFX96TMReal-Time PCR儀上進行熒光定量擴增，檢測SsCCS的表達情況。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，40 個循環，每個樣本重復3 次，采用2-ΔΔCT法計算目的基因表達量[31]。

2 結果

2.1 SsCCS 的生物信息學分析

核盤菌中編碼SsCCS的基因編號為SS1G_00102，該基因全長為1 010 bp，編碼序列長759 bp，共編碼253 個氨基酸，該蛋白分子質量為27 176.96 Da，等電點（PI）為5.04。利用MEGA6.0 軟件構建系統發育樹（圖1），結果顯示與SsCCS同源關系近的基因均為編碼超氧化物歧化酶銅伴侶基因，其中與灰霉病菌（Botrytis cinerea）BcCCS（EDN25358）基因親緣關系最近，氨基酸同源性達到87%，與擬南芥AtCCS（AT1G12520.1）親緣關系較遠。

2.2 HIGS 沉默表達載體的構建

克隆SsCCS的314 bp 特異片段，構建HIGS 沉默表達載體，載體構建示意圖如圖2-A 所示。以野生菌株1980 的cDNA 為模板，分別用特異引物SsCCS-SF/ SsCCS-SR、SsCCS-AF/SsCCS-AR 擴增SsCCS的特異干擾片段CCSs 及CCSa，片段大小為314 bp（圖2-B）。將SsCCS的正向和反向特異干擾片段分別連入pCIT載體的內含子兩端，采用引物PIF/PIR 對p-ccs 的重組菌液進行檢測，結果顯示共獲得8 個片段大小約1 200 bp 的陽性克隆（圖2-C），表明SsCCS干擾載體p-ccs構建成功。提取該質粒，將“CCSs -intron- CCSa”片段插入植物表達載體pBin35SRed3 的EcoRI 和XhoI 兩個酶切位點之間，獲得HIGS 載體R-ccs。隨后，采用EcoRI/XhoI 進行雙酶切檢測R-ccs，酶切片段大小約為1 200 bp（圖2-D），表明植物HIGS 沉默表達載體R-ccs 構建成功。將R-ccs 質粒轉化農桿菌，采用引物組合RVF/SsCCS-SR 進行檢測（圖2-E），結果顯示12 個重組菌液均在314 bp 左右有特異性條帶，表明成功轉化農桿菌，可用于植物的遺傳轉化。

圖1 SsCCS 系統進化樹分析Fig. 1 The phylogenetic tree of SsCCS

圖2 SsCCS HIGS 載體的構建Fig. 2 Construction of HIGS vector of SsCCS

2.3 轉基因擬南芥的篩選及抗病性鑒定

利用浸花序法轉化擬南芥，收獲T0代擬南芥的種子。篩選其中具有紅色熒光的種子，共獲得17 株T1代轉基因植株。提取葉片DNA，利用引物RVF/RVR進行PCR 檢測，結果發現17 株T1代轉基因植株均在1 200 bp 左右有特異性條帶（圖3），表明17 株均為陽性苗。

圖3 T1代轉基因擬南芥的PCR 鑒定Fig. 3 PCR identification of transformed A. thaliana lines of T1 generation

表2 轉基因擬南芥分離比及接種核盤菌后病斑統計Table 2 Segregation and lesion analyses of transgenic and wild type A. thaliana lines after inoculated with S. sclerotiorum

接種核盤菌24 h 后，發現T1代轉基因擬南芥單株的病斑面積均小于野生型，其中有4 個T1代轉基因擬南芥株系的病斑平均面積分別為0.69、0.71、0.89、0.82 cm2，而野生型擬南芥的病斑面積為1.46 cm2（表2）。隨后，收獲T1代的轉基因種子，并對所有種子進行篩選，從符合紅色﹕暗色分離比例為3﹕1 的單株 自交種中，隨機挑選并種植了4 個T2代株系。對T2代進行菌核病抗性評價發現，3 個T2代轉基因擬南芥株系的菌核病抗性顯著強于野生型，其病斑平均面積分別為0.79、0.48、0.55 cm2，野生型病斑面積為1.02 cm2（表2）。從T2代株系中，對抗性表現穩定全部發紅光的株系繼續培養至穩定純合的T3代，菌核病抗性鑒定顯示，接種24 h 后，3 個轉基因T3株系上的病斑明顯小于野生型，3 個株系的病斑平均面積為0.26、0.38、0.27 cm2，野生型病斑面積為0.69 cm2，轉基因株系相對于野生型擬南芥病斑面積減小約46%—61%（圖4）。該結果表明，在擬南芥中表達SsCCS的dsRNA 能顯著增強擬南芥的菌核病抗性。

圖4 T3代轉基因擬南芥株系抗病性鑒定Fig. 4 Resistance identification of T3 generation transgenic A. thaliana lines

圖5 擬南芥野生型及轉基因株系的DAB 染色Fig. 5 DAB staining assay of wild type and transgenic A. thaliana lines

2.4 H2O2的積累情況

利用DAB 染色檢測了HIGS-CCS轉基因擬南芥在接種核盤菌過程中H2O2的積累情況，以此來反應在侵染過程中植株的ROS 發生水平。結果顯示，在接種后6、12、24 h，轉基因株系的染色區域明顯小于野生型，在6 h 時已表現出明顯差異（圖5）。該結果表明， 核盤菌在侵染轉基因擬南芥過程中的致病力顯著小于侵染野生型，側面反映HIGS-CCS轉基因擬南芥的抗性增強。

2.5 SsCCS 表達量分析

提取轉基因株系及野生型接種核盤菌6 h 后的葉片及病斑組織的RNA，通過qRT-PCR 分析核盤菌在侵染轉基因擬南芥過程中相對于侵染野生型核盤菌SsCCS的表達情況，結果發現核盤菌在侵染轉基因擬南芥過程中，SsCCS的表達量相對于侵染野生型擬南芥下降了98%（圖6）。該結果表明，在核盤菌侵染過程中，HIGS-CCS轉基因擬南芥成功干擾了核盤菌SsCCS的表達。

圖6 核盤菌菌株1980 接種野生型及轉基因擬南芥株系6 h后SsCCS 的相對表達量Fig. 6 Relative expression level of SsCCS at 6 h after the wild type and transgenic A. thaliana lines inoculated with S. sclerotiorum strain 1980

3 討論

近年來，越來越多的研究證明HIGS 技術是一種控制病原菌的有效方法，已在多種作物中獲得了HIGS轉基因材料，增強了病原菌抗性，比如小麥-條銹菌[32]、棉花-黃萎病菌[33]、番茄-灰霉病菌[34]等。小RNAs 從植物細胞進入真菌細胞的轉移途徑尚不十分明確，目前大多數的HIGS 研究都集中在專性營養型寄生真菌中，真菌與寄主互作過程中伴隨小RNA 的交換[35]。核盤菌長久以來被認為是一種典型腐生性真菌，通過殺死寄主植物細胞，從死亡組織中獲得營養[36]。但最近的研究發現核盤菌與植物的互作非常復雜，在其侵染早期存在一段短暫的活體營養時期[37]，這為利用HIGS 技術防治核盤菌帶來了可能。ANDRADE 等嘗試在煙草中沉默核盤菌Sschs，發現T1代轉基因煙草的菌核病抗性顯著增強[15]，但是由于HIGS 受到宿主植物與病原菌的限制，不同病原菌的致病基因或寄主植物的選擇可能對于沉默效果有較大的影響[38-39]。本研究中，將含有核盤菌SsCCS的RNAi 結構轉入擬南芥中，獲得了HIGS-CCS轉基因擬南芥，抗性鑒定發現轉基因的T1、T2及T3代的菌核病抗性相對野生型都顯著增強，證明獲得了持久穩定抗菌核病的擬南芥。

CuZn-SOD 在生物體的ROS 平衡調控中起著重要的作用，核盤菌中敲除CuZn-SOD 后，致病力顯著下降[23]，而CCS對于CuZn-SOD 功能的正常行使起到關鍵作用[40]。有研究顯示在灰霉病菌中沉默BcCCS，灰霉菌的致病力減弱[41]。本研究通過構建系統發育樹發現，SsCCS與灰霉病菌BcCCS親緣關系最近，因此推測SsCCS在核盤菌與宿主植物互作過程中起到關鍵作用，干擾該基因的表達可能會增強寄主的抗病能力。而HIGS-CCS轉基因擬南芥中的SsCCS表達受到顯著抑制，核盤菌在侵染轉基因擬南芥過程中的致病力顯著下降，證實了SsCCS是核盤菌致病力的關鍵基因。

擬南芥是分子生物學研究的模式植物，與油菜、蘿卜、卷心菜等農作物同屬于十字花科，具有較近的親緣關系[42]。在擬南芥中進行SsCCS的HIGS，成功獲得了菌核病抗性顯著增強的轉基因植株，研究結果為HIGS 在油菜等十字花科植物的菌核病抗病育種中的應用提供了支撐，同時有助于利用HIGS 技術快速挖掘核盤菌致病相關基因，促進核盤菌致病機理的研究。

4 結論

利用HIGS 方法可有效干擾核盤菌SsCCS的表達，并能夠顯著提高轉基因擬南芥的菌核病抗性，研究結果為安全防控菌核病提供了一個重要的靶標基因。