三種酶對采后‘海沃德’和‘華特’獼猴桃 AsA 的氧化作用

封琦，李朝政，高貴田，吳悠，肖妍，趙武奇，雷玉山

（1 陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2 陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心，西安 710054）

0 引言

【研究意義】抗壞血酸（ascorbic acid，AsA），又稱維生素C（Vc），是廣泛存在于植物中的抗氧化劑主要清除細(xì)胞內(nèi)的氧化物和超氧化物，或作為某些還原酶的輔因子參與還原反應(yīng)[1]。AsA 還參與植物的衰老調(diào)控[2]。另一方面，AsA 是人體不可缺少但無法自身合成，必須從食物中獲取的營養(yǎng)物質(zhì)。獼猴桃（Actinidia）果實(shí)AsA 含量高于大多數(shù)水果，享有“Vc之王”的美稱。深入了解獼猴桃果實(shí)采后AsA 的變化規(guī)律及影響因素，AsA 在成熟與衰老中的作用及其機(jī)制，對調(diào)控果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程并有效保持果實(shí)采后品質(zhì)和延長貯藏時間具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物中AsA 的含量由合成途徑和循環(huán)再生途徑綜合調(diào)節(jié)[3]。AsA 主要合成途徑為L-半乳糖途徑[4]，循環(huán)再生途徑主要為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH）[5]，是氧化態(tài)AsA 再生的主要途徑。在該途徑中，AsA 通過APX[6]或AO[7-8]，將AsA 氧化成單脫氫抗壞血酸（monodehydroascorbate，MDHA），同時AsA 作為電子供體在APX 清除H2O2的過程中被氧化成MDHA[6]，部分MDHA 發(fā)生非酶促歧化反應(yīng)后得到DHA，生成的DHA 借助AsA-GSH 循環(huán)還原成最初的AsA[9]，APX 對AsA 的積累有調(diào)節(jié)作用[10]。MA 等[11]研究表明不同品種獼猴桃果實(shí)AsA 含量存在較大差異。原玉林等[3]研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃果實(shí)生長發(fā)育過程中AsA 含量受合成和再生的共同調(diào)控，不同基因型獼猴桃果實(shí)中AsA 和AsA 相關(guān)氧化物水平存在明顯的多樣性，并且 L-半乳糖 1,4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的活性均與AsA 含量存在極顯著相關(guān)性，并且MDHAR 活性與AsA 含量和APX 都有較高的相關(guān)性。目前，植物AsA 合成與氧化的研究主要集中在AsA 生物合成途徑方面[12]，對果蔬采后AsA 分解氧化及其機(jī)理鮮有報道。薛敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)‘海沃德’獼猴桃果實(shí)在貯藏期AsA 氧化率高達(dá)61.5%，另有研究表明，‘華特’獼猴桃在采后AsA 含量始終保持較高水平，在貯藏末期AsA的氧化率只有10%[14]。【本研究切入點(diǎn)】筆者課題組前期采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)‘海沃德’獼猴桃采后AsA 氧化通路中AO、漆酶基因家族中存在表達(dá)差異[15]，并用實(shí)時熒光定量PCR 進(jìn)行了驗(yàn)證，為從基因水平研究獼猴桃采后AsA 分解氧化奠定了基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以AsA 含量較低、采后流失嚴(yán)重的‘海沃德’獼猴桃和AsA 含量高、采后流失少的‘華特’獼猴桃作為試驗(yàn)材料，通過研究兩個品種的獼猴桃在采后25℃貯藏條件下AsA 含量和相關(guān)酶活性及其基因表達(dá)的變化差異，以期探明影響獼猴桃AsA 含量變化的相關(guān)機(jī)制，為今后通過基因?qū)用婢S持和減少獼猴桃果實(shí)采后AsA 的損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘華特’獼猴桃、‘海沃德’獼猴桃，于2017 年10 月21 號采于周至縣虎峰村的陜西佰瑞獼猴桃研究院有限公司實(shí)驗(yàn)基地。

挑選果型大小均勻、完整、無病蟲害的果實(shí)于采后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。‘華特’獼猴桃、‘海沃德’獼猴桃分別按每30 個一組放入已消毒的筐中，框外側(cè)套厚度為0.05 mm 的聚乙烯薄膜袋，讓袋口處于自然合攏狀態(tài)，置于（25±0.5）℃的恒溫箱貯藏；每隔5 d 分別選‘華特’獼猴桃30 個和‘海沃德’獼猴桃30 個，取果實(shí)果肉、中軸部分將其切碎混合后用液氮速凍，用錫箔紙把樣品包好后存放在-80℃冰箱，用于酶活測定及基因表達(dá)研究。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：pH 計，北京科偉永興儀器公司；超高速低溫離心機(jī)，美國Sigma 公司；紫外分光光度計，瑞典福斯公司；全波長酶標(biāo)儀，美國熱電公司；BIO-RAD梯度PCR 儀，北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司；DYY-4C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；格蘭仕微波爐，格蘭仕微波爐電器有限公司；XW-80A 漩渦混合儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JY02G 型凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；NanoDrop 2000 微量快速核酸定量儀，賽默飛爾公司；RF-6000 熒光定量PCR 儀，美國熱力公司。

分析純化學(xué)試劑：BP（純度＞97.0%），磷酸，無水乙醇，標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸，氯化鐵（FeCl3），三氯乙酸（TCA）購于天津天力化學(xué)試劑有限公司；HiPure Plant RNA Mini Kit，美基生物工程有限公司；Light cycler RNA SYBR green I，Sigma 生物工程有限公司；TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，北京艾德萊生物科技有限公司；DNA Marker-D、6×Loading Buffer、EDTA、Tris-HCl、瓊脂糖，TaKaRa（大連）生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 T-AsA、AsA、DHA 含量測定 參考趙玉梅等[16]的方法測定。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：在波長534 nm 處測定吸光值，將AsA 質(zhì)量設(shè)置為橫坐標(biāo)，吸光度值設(shè)置為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求線性回歸方程。

樣品提取：準(zhǔn)確稱4.0 g 獼猴桃果實(shí)樣品，放入已加5 mL 50 g·L-1TCA 溶液的研缽中，冰浴條件下將樣品研磨成勻漿后轉(zhuǎn)移到25 mL 的容量瓶，用TCA 溶液沖洗研缽一并轉(zhuǎn)移到容量瓶后定容至刻度，搖勻，冰浴條件下提取10 min 后過濾，將濾液4℃、12 000×g離心10 min 后收集上清液，即樣品提取液。低溫備用（‘華特’獼猴桃果實(shí)上清液需稀釋10 倍備用）。

T-AsA 測定：取1.0 mL 樣品提取液，加0.5 mL濃 度 為 60 mmol·L-1的 DTT- 乙 醇 溶 液， 用Na2HPO4-NaOH 溶液將pH 調(diào)至7—8，室溫下靜置10 min，加0.5 mL 的TCA 溶液。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法進(jìn)行測定。記錄波長534 nm 處的吸光值。重復(fù)3 次。

AsA 測定：取1.0 mL 樣品提取液，加1.0 mL 的TCA 溶液，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法進(jìn)行測定。記錄波長534 nm 處的吸光值。重復(fù)3 次。

DHA 含量等于樣品中T-AsA 的含量減去原有的AsA 的含量。

1.3.2 漆酶、AO、APX 活性的測定 漆酶、AO、APX活性測定用Mlbio 酶聯(lián)免疫分析試劑盒（分別為Plant Laccase ELISA KIT、Plant AO ELISA KIT、Plant APX ELISA KIT）進(jìn)行測定。

1.3.3 RNA 的提取及質(zhì)檢 裂解液加入濃度為2%（w/v）的PVP-40，其余步驟按照植物RNA 小提試劑盒說明書（HiPure Plant RNA Mini Kit）進(jìn)行；通過2%的瓊脂糖凝膠電泳和微量快速核酸定量儀檢測RNA的純度、濃度。

1.3.4 單鏈cDNA 的合成 將檢測合格的RNA 使用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行單鏈cDNA 合成。

1.3.5 熒光定量PCR 用Gene ID 在獼猴桃數(shù)據(jù)庫（http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi）檢索并獲得相應(yīng)基因的CDS 區(qū)[17]，通過Primer 6.0軟件，在NCBI 上使用Primer-BLAST 程序?qū)⒃O(shè)計的引物進(jìn)行模擬擴(kuò)增，通過比對引物擴(kuò)增的特異性，篩選出特異性最強(qiáng)的熒光定量PCR 引物對，引物見表1。

按照Light cycler RNA SYBR green I 試劑盒操作，以18s RNA 基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性10 min，90℃變性20 s、61℃退火20 s，40 個循環(huán)，熔解曲線溫度范圍為55—95℃。分析熒光值變化曲線及熔解曲線，用2-△△Ct法計算兩個品種獼猴桃在不同的貯藏天數(shù)時AO、漆酶、APX相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 分析使用的引物Table 1 Primers for quantitative real-time PCR

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 樣品進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)取平均值，運(yùn)用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異性分析，取P＜0.05 為顯著相關(guān)，P＜0.01 為極顯著相關(guān)，采用Origin 8.6 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 獼猴桃中T-AsA、AsA、DHA 含量

‘海沃德’和‘華特’獼猴桃在采后貯藏期AsA含量存在顯著差異（圖1-A）。‘海沃德’獼猴桃果實(shí)采后第1 天AsA 含量只有‘華特’獼猴桃的14%，在第6—11 天下降速度加快，在第11—21 天下降速度又趨于平緩，在貯藏末期，AsA 含量下降了約45%，損失嚴(yán)重。‘華特’獼猴桃采后貯藏期AsA 含量遠(yuǎn)高于‘海沃德’獼猴桃，含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；在第6—11 天AsA 含量急劇上升并達(dá)到峰值，從第11 天到貯藏末期，AsA 含量緩慢下降，仍高于采后第1 天AsA 含量，整體呈上升趨勢。

‘海沃德’獼猴桃DHA 含量在整個貯藏期都低于‘華特’獼猴桃，兩個品種都呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢（圖1-B）。‘海沃德’獼猴桃第1—16 天DHA含量處于緩慢下降的趨勢，在第16—21 天含量略有回升，在第21 天仍低于初期含量。‘華特’獼猴桃在采后第1—16 天，DHA 含量處于較快下降的趨勢且達(dá)到最低點(diǎn)，16 d 之后含量開始回升，但仍遠(yuǎn)低于初期含量。

‘海沃德’和‘華特’獼猴桃的T-AsA 含量與其AsA 含量的變化趨勢接近（圖1-C）。T-AsA 是AsA與DHA 之和，由于兩個品種的獼猴桃果實(shí)中AsA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DHA 含量，因此，AsA 含量的變化直接影響T-AsA 的變化趨勢。

2.2 獼猴桃AsA/DHA 比值的變化

AsA/DHA 的比值反應(yīng)果實(shí)中AsA 的氧化還原狀態(tài)和程度。如圖2，‘海沃德’和‘華特’獼猴桃在采后初期AsA/DHA 比值接近，‘海沃德’AsA/DHA比值整體緩慢波動呈下降趨勢，而‘華特’呈先上升后下降趨勢。在貯藏第1—6 天，兩個品種的AsA/DHA比值都略微上升，‘華特’上升較快。‘海沃德’在第6—11 天，AsA/DHA 比值呈下降趨勢。‘華特’在第6—16 天，比值急劇上升且達(dá)到頂峰。在整個貯藏后期，‘海沃德’獼猴桃的AsA/DHA 比值遠(yuǎn)低于‘華特’。

2.3 獼猴桃AO、漆酶、APX 活性的變化

‘海沃德’獼猴桃在貯藏期AO 活性呈先上升后下降的趨勢，且在采后初期低于‘華特’，第1—16天緩慢上升，在第16 天達(dá)到最高值后呈下降趨勢。‘華特’獼猴桃在貯藏期AO 活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，第11 天到達(dá)最低值，之后活性上升，但仍低于‘海沃德’（圖3-A）。

在整個采后貯藏期，‘海沃德’獼猴桃的漆酶活性始終高于‘華特’，但兩者變化趨勢相似，均表現(xiàn)為先下降后上升再下降的趨勢。‘海沃德’獼猴桃漆酶活性在第16 天達(dá)到峰值后開始下降，在貯藏末期活性仍高于‘華特’；‘華特’獼猴桃在貯藏第1—11 天時漆酶活性呈快速下降趨勢，在第11天達(dá)到最低值，貯藏末期的活性只有‘海沃德’的一半（圖3-B）。

‘華特’獼猴桃在貯藏期APX 活性始終高于‘海沃德’，且在第1 天遠(yuǎn)高于‘海沃德’，在采后第1—6天，‘華特’APX 活性迅速下降，在貯藏后期，呈現(xiàn)波動變化趨勢，但始終維持在20 U·g-1FW 以上。‘海沃德’獼猴桃APX 活性在貯藏過程中呈先上升后下降的趨勢，在第11 天達(dá)到峰值，隨后開始下降，貯藏后期活性始終維持在14.5 U·g-1FW 左右（圖3-C）。

圖1 兩個品種獼猴桃采后AsA(A)、DHA(B)、T-AsA(C)含量變化Fig. 1 Changes of AsA (A), DHA (B), and T-AsA (C) contents of two varieties of kiwifruit during storage

圖2 兩個品種獼猴桃采后AsA/DHA 比值變化Fig. 2 Changes of AsA/DHA ratio of two varieties of kiwifruit during storage

圖3 兩個品種獼猴桃采后AO（A）、漆酶（B）、APX（C）活性變化Fig. 3 Changes of AO (A), laccase (B) and APX (C) activities of two varieties of kiwifruit during storage

2.4 獼猴桃AsA 含量與T-AsA、AsA/DHA 及3 個酶的相關(guān)性分析

如表2，‘海沃德’獼猴桃中AsA 含量與T-AsA含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)為0.999，與AO 活性呈顯著負(fù)相關(guān)性且相關(guān)系數(shù)為0.910；‘華特’獼猴桃AsA 含量與T-AsA 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），且相關(guān)系數(shù)為0.993，與AO 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），且相關(guān)系數(shù)為0.958。

表2 兩個品種獼猴桃AsA 含量與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)Table 2 Relation coefficient among AsA content and related indexes of two varieties of kiwifruit

2.5 兩個品種獼猴桃AsA 氧化相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的變化

Achn020161、Achn230551和Achn316521是獼猴桃AO 基因家族中的3 個基因。兩個品種的獼猴桃采后貯藏期內(nèi)，Achn020161的表達(dá)變化趨勢如圖4-A 所示，在‘海沃德’中的表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值；‘華特’獼猴桃的表達(dá)量沒有明顯變化，且整個貯藏期表達(dá)量都明顯低于‘海沃德’。從圖4-B 可以看出，‘海沃德’獼猴桃Achn230551處于表達(dá)量較低的狀態(tài)，且始終低于‘華特’；在‘華特’中，其表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值，第21 天時與最初表達(dá)量持平。由圖4-C 可知，‘海沃德’獼猴桃Achn316521表達(dá)量在第6 天達(dá)到最高表達(dá)量后急劇下降，第11 天后開始上升；‘華特’獼猴桃其基因表達(dá)量呈波動變化，貯藏末期與最初表達(dá)量沒有明顯差異。

圖4 兩個品種獼猴桃AsA 氧化相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的變化Fig. 4 Changes of expression levels of related enzyme genes of two varieties of kiwifruit during storage

Achn007661、Achn191341、Achn163871是獼猴桃漆酶基因家族中的3 個基因。由圖4-D 可見，在獼猴桃整個采后貯藏期內(nèi)，‘海沃德’Achn007661表達(dá)量在第16 天最高，‘華特’的表達(dá)量一直明顯低于‘海沃德’。Achn191341在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量總體呈上升的趨勢，第16 天表達(dá)量達(dá)到峰值且是第1天的5 倍；‘華特’獼猴桃表達(dá)量變化趨勢不明顯，且第6 天后明顯低于‘海沃德’（圖4-E）。‘海沃德’獼猴桃Achn163871表達(dá)量在第11 天達(dá)到最高；‘華特’獼猴桃其表達(dá)量呈持續(xù)上升趨勢，且貯藏末期高于‘海沃德’（圖4-F）。

Achn123021、Achn082241、Achn187071是獼猴桃APX 基因家族中的3 個基因。‘海沃德’獼猴桃Achn123021表達(dá)量在第16 天達(dá)到峰值；‘華特’獼猴桃其表達(dá)量在第1—6 天急劇上升，到貯藏末期相比于第1 天上升了約4 倍（圖4-G）。‘海沃德’中Achn082241表達(dá)量始終高于‘華特’，第11 天表達(dá)量達(dá)到峰值；在‘華特’中的表達(dá)量變化整體差異不明顯（圖4-H）。‘海沃德’獼猴桃中Achn187071表達(dá)量在第11 天表達(dá)量開始急劇上升；‘華特’獼猴桃的表達(dá)量在前期稍有下降，但整體變化趨勢不明顯（圖4-I）。

2.6 獼猴桃AsA含量與AsA氧化相關(guān)酶基因相對表達(dá)量的相關(guān)性

如表3 所示，AO 基因家族中，Achn020161表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃果實(shí)中AsA 含量的變 化具有顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.922、0.920；Achn191341表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中的AsA 含量變化正相關(guān)，與‘華特’沒有顯著相關(guān)性；Achn316521表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃的AsA 含量無顯著相關(guān)性。

漆酶基因家族中，Achn007661表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃貯藏期AsA 含量的變化呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.947、0.950；Achn191341表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中的AsA 含量的變化呈負(fù)相關(guān)，與‘華特’沒有顯著相關(guān)性；Achn163871表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃中AsA 含量的變化沒有顯著相關(guān)性。

APX 基因家族中，Achn123021表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中AsA 的含量變化呈負(fù)相關(guān)性，與‘華特’沒有顯著相關(guān)性；Achn082241表達(dá)量與‘海沃德’‘華特’獼猴桃中的 AsA 含量變化無顯著相關(guān)性；Achn187071表達(dá)量與‘海沃德’獼猴桃中AsA 含量呈負(fù)相關(guān)，與‘華特’無顯著相關(guān)性。

表3 兩個品種獼猴桃AsA 含量與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Relation coefficient among AsA content and genes expression of two varieties of kiwifruit

3 討論

3.1 AsA/DHA 對獼猴桃采后AsA 氧化的影響

獼猴桃以富含高AsA 而著名，但在貯藏后期，不同品種的獼猴桃果實(shí)AsA 的損失情況有顯著差異。‘華特’獼猴桃具有較高的AsA 含量且在采后貯藏期流失較少[14]。而‘海沃德’獼猴桃與‘華特’相比，AsA 在采后貯藏期損失很大[18]。DHA 是AsA 中的一種氧化產(chǎn)物，AsA 很容易在酶的作用下氧化，同時在脫氫抗壞血酸還原酶的作用下，DHA 還可以轉(zhuǎn)化為AsA 以維持較高水平。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，‘華特’獼猴桃AsA 含量是‘海沃德’的8—10 倍，與原玉林等[3]的研究結(jié)果一致；造成AsA 含量差異的主要因素為AsA合成和循環(huán)再生機(jī)制，‘華特’貯藏前期出現(xiàn)AsA 含量的上升現(xiàn)象，說明果實(shí)中的AsA 合成和再生的協(xié)作速率大于氧化速率。有研究表明，‘華特’貯藏前期DHAR 活性上升，后期受到反饋抑制活性下降[19]，因此，DHAR 以DHA 為底物會促進(jìn)果實(shí)貯藏前期AsA含量的積累；‘海沃德’獼猴桃剛好與其相反，說明‘海沃德’AsA 氧化速度大于再生合成的速度。‘華特’獼猴桃DHA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于‘海沃德’，兩者變化趨勢一致，DHA 除自身氧化外還參與AsA 再生循環(huán)。由于獼猴桃中AsA 含量遠(yuǎn)高于DHA 含量，所以，‘華特’和‘海沃德’的T-AsA 含量變化趨勢與AsA基本保持一致，受DHA 變化影響很小。AsA/DHA 的比值反映的是果實(shí)中AsA 的氧化還原狀態(tài)[18]，比值越大，說明抗氧化能力越高[20]，越有利于維持果實(shí)中T-AsA 的含量。AsA/DHA 的高比值可以阻止AsA的降解，‘華特’在貯藏期內(nèi)AsA 含量整體上升而DHA 下降，保持著較高的AsA 再生能力，AsA 再生酶可能對其后期可以保持較高的抗氧化能力也起到一定作用[21]。‘華特’獼猴桃和‘海沃德’獼猴桃在貯藏過程中AsA/DHA 的比值存在顯著差異，較高含量的DHA 還原以及AsA/DHA 的高比值對AsA 的積累起到重要作用。

3.2 3 種酶對獼猴桃采后AsA 氧化的影響

通過AsA-GSH 循環(huán)，植物有清除活性氧（ROS）的能力，同時，AsA 會被氧化為單脫氫抗壞血酸（MDAH），這種能力在酶的催化下會增強(qiáng)。前人研究表明，在AsA-GSH 循環(huán)中，AO 在有氧情況下，APX 提供電子供體是AsA 分解氧化的主要途徑，植物APX 表達(dá)受生物和非生物脅迫以及植物發(fā)育期間的調(diào)節(jié)[22-24]。漆酶是一種含銅多酚氧化酶[25]，作為催化劑可清除ROS，也可與抗壞血酸、胺類等物質(zhì)反應(yīng)[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，AO 活性與兩個品種獼猴桃AsA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)性；漆酶活性與兩個品種獼猴桃AsA 含量呈負(fù)相關(guān)性，與筆者課題組前期基于轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)漆酶可能是‘海沃德’采后氧化AsA 酶的結(jié)論一致[15]。獼猴桃AO 和漆酶活性在‘華特’采后第11 天達(dá)到最低值，在‘海沃德’采后第16 天達(dá)到最高值，而在采后第11 天‘華特’獼猴桃的AsA 含量上升到峰值，DHA 的含量接近最低值，推測這是導(dǎo)致‘華特’獼猴桃AsA 含量在貯藏后期始終維持較高含量而‘海沃德’AsA 含量呈下降趨勢的主要原因。進(jìn)一步比較AO 與漆酶的活力，發(fā)現(xiàn)AO 是漆酶活力的3—4 倍，據(jù)此推測，AO 是導(dǎo)致兩個品種獼猴桃采后氧化的關(guān)鍵酶，漆酶對獼猴桃采后AsA 的氧化有一定的作用。而APX的活力變化趨勢在兩個品種之間差異較大，在采收當(dāng)天，‘華特’獼猴桃是‘海沃德’的2 倍多，在采后第7—21 天，‘華特’始終高于‘海沃德’；在采后第1—6 天，‘華特’APX 活力劇增，與其采后1—6 天的AsA 升高及DHA 降低的變化吻合，但采后第7—21 天，APX 活力變化與AsA 及DHA變化吻合度較低。而‘海沃德’APX 活力與其采后AsA 含量的相關(guān)系數(shù)僅為0.253，因此，APX 不是兩個品種氧化AsA 的主要酶，這與鐘雨[28]在‘華特’獼猴桃中的研究結(jié)果一致。植物中AsA-GSH循環(huán)途徑需要多個同工酶共同參與[29]，這3 種酶對于ROS 的清除應(yīng)該都有一定的作用，但具體如何參與ASA 的氧化并不清楚，還需要進(jìn)一步探究驗(yàn)證。

3.3 相關(guān)基因?qū)ΛJ猴桃采后AsA 氧化的影響

AO 基因家族中，Achn020161在兩個品種獼猴桃中的表達(dá)變化趨勢與其對應(yīng)的酶活性變化趨勢相近，與其AsA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，推測該基因是導(dǎo)致兩個品種獼猴桃AsA 氧化的關(guān)鍵基因之一。Achn230551、Achn316521表達(dá)量與AsA 含量無顯著相關(guān)性，推斷這兩個基因可能并不參與調(diào)控AO 氧化AsA 的過程。

漆酶基因家族的Achn007661與Achn191341在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量顯著高于‘華特’；‘華特’獼猴桃Achn007661與Achn191341在采后平穩(wěn)下降，與其對應(yīng)品種的漆酶活性變化趨勢基本一致，相關(guān)分析表明Achn007661與Achn19134與兩個品種AsA 變化分別為極顯著相關(guān)與負(fù)相關(guān)，推測Achn007661與Achn19134對氧化AsA 有一定影響。Achn163871表達(dá)量在‘海沃德’獼猴桃中為先上升后下降的趨勢，第11 天表達(dá)量達(dá)到最高，與漆酶活力變化趨勢一致；但在‘華特’獼猴桃中的表達(dá)量持續(xù)上升，且貯藏末期高于‘海沃 德’，與漆酶活力變化趨勢相反，表明Achn163871與兩個品種獼猴桃氧化 AsA 無相關(guān)性，也暗示Achn163871可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

APX 基因家族的Achn123021在‘海沃德’獼猴桃中表達(dá)量與APX 活力的變化趨勢一致，與AsA 含量呈負(fù)相關(guān)性；但在‘華特’中采后第1—6 天APX活力下降一半，其表達(dá)量反而上升，采后第11 天，Achn123021表達(dá)量是采收當(dāng)天的4.5 倍，與AsA 含量上升的表型相反。在兩個品種中，Achn082241、Achn187071表達(dá)量變化與 APX 活力變化趨勢相近，但兩個基因的表達(dá)量在‘海沃德’中顯著高于‘華特’，與‘華特’APX 活性整體高于‘海沃德’的結(jié)果相反。其原因可能是由于本研究中APX基因家族Achn082241、Achn187071的CDS 序列來自中華獼猴桃‘紅陽’基因組數(shù)據(jù)庫[17]，而本研究所用的材料是美味獼猴桃‘海沃德’與毛花獼猴桃‘華特’，與中華獼猴桃‘紅陽’存在較大的遺傳差異[30-31]，APX 基因編碼區(qū)的序列也可能存在一定的多態(tài)性。另一方面，較多的研究表明APX 在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等生理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用，它催化H2O2依賴的L-抗壞血酸發(fā)生氧化作用，對AsA 表現(xiàn)出高度的專一性[23,32-33]。本研究不論從酶學(xué)層面，還是基因?qū)用婢砻鰽PX與兩個品種采后AsA 氧化相關(guān)性低，其原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

較高含量的脫氫抗壞血酸還原以及AsA/DHA 的高比值對抗壞血酸（AsA）的積累起重要作用。抗壞血酸氧化酶（AO）是氧化AsA 的關(guān)鍵酶，漆酶對氧化AsA 有一定作用，抗壞血酸過氧化物酶（APX）不是主要氧化AsA 的酶。推測AO 基因家族中的基因Achn020161是導(dǎo)致AO 氧化AsA 的關(guān)鍵基因，而Achn191341和Achn316521則與AsA 氧化相關(guān)性不明顯；漆酶基因家族中的基因Achn007661對AsA 氧化有一定作用，Achn191341、Achn163871與AsA 的氧化沒有顯著相關(guān)性；APX 基因家族中的3 個基因Achn123021、Achn082241、Achn187071不是氧化AsA的關(guān)鍵基因。