軟糖類產(chǎn)品中蝦青素的檢測及穩(wěn)定性研究

孔慶龍，荊雯，張曉南，余汪平，游燕*

1(云南省藥物研究所, 云南 昆明， 650111) 2(云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心, 云南 昆明，650111)3(云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室, 云南 昆明，650111) 4(昆明理工大學(xué), 云南 昆明，650500)

蝦青素(astaxanthin)是一種重要的紅色脂溶性類胡蘿卜素，具有高效的生物學(xué)活性，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的天然抗氧化劑之一，已有大量研究表明它能發(fā)揮強大的抗氧化作用，不僅可以有效地提高機(jī)體免疫力、增強細(xì)胞的再生能力、抗衰除皺、防曬美白、抑制腫瘤、治療心血管疾病、預(yù)防過度訓(xùn)練引發(fā)的骨骼肌及臟器損傷，還是目前唯一能夠通過血腦屏障、將各種抗氧化有益成分直接傳送到大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種非維生素A源性的天然類胡蘿卜素，具有治療眼疾、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能[1-21]。因此蝦青素在普通食品、保健食品、醫(yī)藥行業(yè)及化妝品行業(yè)均有廣泛的應(yīng)用。蝦青素廣泛地分布在海洋的細(xì)菌、藻類、甲殼類和魚類中等，雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是天然蝦青素含量最高的生物，其中蝦青素的含量可高達(dá)細(xì)胞干重的1%～3%，被公認(rèn)為自然界中天然蝦青素最好的生物來源[22-25]，同時是FDA唯一批準(zhǔn)可用于保健及醫(yī)療行業(yè)的天然蝦青素來源，也是我國批準(zhǔn)的可用于食品行業(yè)的新資源食品。

雨生紅球藻雖然被批準(zhǔn)用于食品生產(chǎn)，但因其中蝦青素的低水溶性和化學(xué)不穩(wěn)定性等性質(zhì)，使其不能滿足某些特殊需求，導(dǎo)致目前市場上蝦青素產(chǎn)品劑型不夠豐富，難以滿足多元化應(yīng)用的需求。已經(jīng)有研究指出，通過微囊包裹的方法，將雨生紅球藻制成微囊粉，可以提高蝦青素穩(wěn)定性，并改善加工性能[26-31]，但目前并沒有針對雨生紅球藻微囊粉在實際生產(chǎn)加工中的應(yīng)用及其最終產(chǎn)品蝦青素含量的研究。本文通過對比使用雨生紅球藻粉和雨生紅球藻微囊粉2種原料制成的糖果中蝦青素在不同溫度、光照、氧氣條件下的含量，來研究雨生紅球藻微囊粉中蝦青素的加工穩(wěn)定性問題，期望為雨生紅球藻微囊粉在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

目前法定標(biāo)準(zhǔn)中沒有針對軟糖中的蝦青素含量的測定方法，為保證檢測結(jié)果可靠，根據(jù)GB/T 31520-2015《紅球藻中蝦青素的測定液相色譜法》制訂了產(chǎn)品中蝦青素的含量測定方法，并進(jìn)行了方法適應(yīng)性研究，以此方法對產(chǎn)品中蝦青素含量進(jìn)行檢測對比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

雨生紅球藻粉(蝦青素含量為3%，以下簡稱藻粉)、雨生紅球藻微囊粉(蝦青素含量≥2.5%，以下簡稱微囊粉)，云南艾爾發(fā)；全反式蝦青素對照品(批號：160619001，純度100%)，江萊生物科技有限公司；13-順蝦青素對照品(批號：BCBQ2118，純度≥90.0%)，SIGMA；9-順蝦青素對照品(批號：BCBQ2518V，純度≥90.0%)，SIGMA。所用流動相水為超純水，叔丁基甲基醚、甲醇為色譜純，處理樣品的磷酸、NaOH為優(yōu)級純，甲醇、二氯甲烷、丙酮、2，6-二叔丁基對甲酚為分析純。

雨生紅球藻軟糖樣品,晉江奇峰食品有限公司，為中試樣品，包裝形式為鋁復(fù)袋獨立包裝，藻粉及微囊粉添加量均為1%。

1.1.2 儀器

Agilent 1100t型高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司；SK3200LH型超聲波清洗儀,上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；AG285型電子天平,梅特勒-托利多公司；Advantage A10型Milli-Q純水機(jī)，德國Merck公司；LHS-500HC-Ⅰ恒溫恒濕箱,上海一恒。

1.2 蝦青素含量測定方法的建立

1.2.1 色譜條件選擇

參照GB/T 31520—2015《紅球藻中蝦青素的測定液相色譜法》，選擇C30色譜柱：YMC Caratenoid(5 μm，4.6×250 mm)。以甲醇為流動相A，以叔丁基甲基醚為流動相B，以體積分?jǐn)?shù)1%磷酸溶液為流動相C，按表1進(jìn)行梯度洗脫。柱溫25 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution

1.2.2 檢測波長的選擇

對全反式蝦青素對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，如圖1所示，全反式蝦青素在波長475 nm有一個最大吸收峰，因此選擇在此波長進(jìn)樣測定。

圖1 全反式蝦青素全波長掃描圖Fig.1 Total trans-astaxanthin full wavelength scan

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品36.7 mg，于500 mL容量瓶中加入丙酮溶解，定容。充氮密封，置-18 ℃的冰箱中避光保存，有效期1個月。

13-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取13-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品約1 mg于50 mL容量瓶中，加入丙酮溶解，定容。充氮密封，置-18 ℃的冰箱中避光保存，有效期1個月。

9-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取9-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品約1 mg于50 mL容量瓶中，加入丙酮溶解，定容。充氮密封，置-18 ℃的冰箱中避光保存，有效期1個月。

混合標(biāo)準(zhǔn)品液：取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液2 mL，13-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL，9-順蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL于同一個10 mL容量瓶中加入丙酮溶解，定容。-18 ℃的冰箱中避光保存。此溶液只用于定性。

全反式蝦青素工作液：取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于10 mL容量瓶中加入丙酮溶解，定容。臨用現(xiàn)配。

1.2.4 樣品制備

參照GB/T 31520—2015《紅球藻中蝦青素的測定液相色譜法》，并根據(jù)產(chǎn)品特性，對蝦青素的提取和供試品溶液的保存方法進(jìn)行了調(diào)整。

藻粉及微囊粉中蝦青素提取：分別稱取藻粉和微囊粉樣品0.5 g，分5次加入二氯甲烷-甲醇(體積比25∶75)液，每次10 mL，提取出蝦青素。提取液合并于50 mL容量瓶中，定容，待用。

軟糖中蝦青素提取：稱取軟糖樣品約10 g，加水5 mL攪碎呈勻漿狀，分5次加入二氯甲烷-甲醇(體積比25∶75)液，每次10 mL，提取出蝦青素。提取液合并于50 mL容量瓶中，定容，待用。

皂化：準(zhǔn)確移取提取液5 mL，于離心管中加入新配的0.1 mol/L的NaOH甲醇溶液1.0 mL，混勻，充氮氣，密封，在5 ℃冰箱中避光反應(yīng)過夜(12 h以上)，再加入體積分?jǐn)?shù)1%磷酸甲醇溶液0.5 mL中和剩余的堿，混勻，在氮氣吹掃下定容至5 mL，用0.45 μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。上述供試品溶液進(jìn)樣前須保存在-18 ℃的冰箱冷凍室內(nèi)，并于進(jìn)樣前15～20 min取出，進(jìn)行HPLC分析。

由于皂化后供試品溶液在常溫中極易發(fā)生成分改變，形成眾多雜質(zhì)峰，因此規(guī)定供試品溶液進(jìn)樣前須保存在-18 ℃的冰箱冷凍室內(nèi)，并于進(jìn)樣前15～20 min取出。各條件下色譜圖如圖2所示。

A-完全皂化供試品溶液(加入1.0 mL堿液);B-未完全皂化供試品溶液(加入0.7 mL堿液)C-未皂化供試品溶液;D-室溫25 ℃放置5 h后供試品溶液圖2 蝦青素不同前處理條件色譜圖Fig.2 Chromatogram of astaxanthin under differentpretreatment conditions

1.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

按上述色譜條件分別進(jìn)樣混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、空白樣品液各10 μL，柱溫25 ℃。

1.2.6 線性關(guān)系考察

精密量取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(質(zhì)量濃度73.4 μg/mL)0.15、0.45、0.9、1.8、9 mL，置10 mL容量瓶中，加二氯甲烷-甲醇稀釋至刻度，搖勻，按選定色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。

1.2.7 加樣回收試驗

全反式蝦青素對照品液：精密稱取全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品41.2 mg于100 mL容量瓶中，加入丙酮溶解，定容。于-18 ℃的冰箱中避光保存。9-順蝦青素和13-順蝦青素為其標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

精密稱取同一批號微囊粉軟糖供試品9份，已測含蝦青素0.167 2 mg/g，每份約10.35 g，分別加入以上全反式蝦青素對照品液5 mL，9-順蝦青素和13-順蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5 mL共3份；全反式蝦青素對照品液10 mL，9-順蝦青素和13-順蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL共3份；全反式蝦青素對照品液15 mL，9-順蝦青素和13-順蝦青素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.5 mL共3份。按供試品溶液處理方法同法處理，按照含量測定方法依法測定，記錄峰面積，按GB/T31520—2015《紅球藻中蝦青素的測定液相色譜法》所載公式計算總峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蝦青素含量。

1.2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號的微囊粉軟糖樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，按照含量測定方法依法測定，記錄峰面積，按GB/T 31520—2015《紅球藻中蝦青素的測定液相色譜法》所載公式計算總峰面積，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蝦青素含量。

1.3 產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗

1.3.1 光照穩(wěn)定性

將用藻粉和微囊粉制備的軟糖樣品分為2組，一組用透明袋包裝，另一組用鋁復(fù)袋包裝，于溫度20 ℃、濕度75%、光照強度6 000 lx條件下存放3個月，每隔30天取樣檢測。

1.3.2 熱穩(wěn)定性

將用藻粉和微囊粉制備的軟糖樣品用鋁復(fù)袋包裝，于溫度40 ℃、濕度75%、避光條件下存放3個月，每隔30天取樣檢測。

1.3.3 氧氣環(huán)境穩(wěn)定性

將用藻粉和微囊粉制備的軟糖樣品分別分為2組，一組用鋁復(fù)袋真空包裝，另一組用鋁復(fù)袋正常包裝，于溫度20 ℃、濕度75%、避光條件下存放3個月，每隔30天取樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦青素含量測定方法建立

2.1.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

由圖2可以看出，供試品溶液色譜與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜在全反式蝦青素、13-順蝦青素及9-順蝦青素相應(yīng)的位置上均有相同的色譜峰出現(xiàn)。樣品空白溶液在全反式蝦青素、13-順蝦青素及9-順蝦青素色譜峰對應(yīng)位置上均無色譜峰，表明溶液中其他成分對樣品的含量測定無干擾。

供試品色譜圖中，理論板數(shù)達(dá)到5 000時，全反式蝦青素、13-順蝦青素及9-順蝦青素的峰與前后色譜峰分離完全，被測成分色譜峰與其它相鄰色譜峰分離度能達(dá)到要求。

A-混合對照品溶液;B-供試品溶液;C-全反式蝦青素工作液;D-樣品空白溶液圖3 系統(tǒng)適應(yīng)性圖Fig.3 System adaptability

2.1.2 線性關(guān)系

如表2所示，在上述色譜條件下，全反式蝦青素在0.011 0～0.660 6 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測方法適用于蝦青素檢測。以含量(x)對峰面積(y)進(jìn)行線性回歸，得全反式蝦青素回歸方程：y=8 657.3x+33.397，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

表2 線性關(guān)系測定結(jié)果Table 2 Linear relationship determination results

2.1.3 加樣回收試驗

如表3所示，總回收率平均值為100.64%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard relative deviation, RSD)為2.25%，所用樣品為微囊軟糖。

2.1.4 重復(fù)性試驗

計算得RSD小于2%，結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性，見表4。所用樣品為微囊粉軟糖。

表3 加樣回收率試驗Table 3 Recovery of added samples test

表4 重復(fù)性試驗Table 4 Repeatability test

2.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

因原料在儲存過程中可能有蝦青素?fù)p失，故對原料進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表5。

表5 原料蝦青素含量表Table 5 Astaxanthin content in raw materials

測量結(jié)果與標(biāo)示含量相比，原料由生產(chǎn)到使用中均有一定的損失。

2.2.1 光照穩(wěn)定性

根據(jù)圖4和圖5的結(jié)果，在光照條件下，不論是采用藻粉還是微囊粉制備的軟糖其蝦青素保留率均有明顯的下降，經(jīng)過3個月存放蝦青素減少量為7.5%和30.26%，最終保留率為1.02%和37.57%；而避光存放的樣品雖然同樣有下降現(xiàn)象，但經(jīng)過3個月存放蝦青素減少量為6.89%和12.68%，其減少量明顯小于光照條件，最終保留率為1.82%和55.02%，以上結(jié)果說明在試驗周期中，蝦青素受光照的影響導(dǎo)致降解，這與蝦青素本身在強光環(huán)境下穩(wěn)定性極差的性質(zhì)相符，由此可推斷光照是引起蝦青素分解的主要原因之一。同時我們可以看出，以微囊粉為原料的軟糖其蝦青素保留率明顯好于以藻粉為原料制備的軟糖，表面微囊粉囊壁可以對光照產(chǎn)生一定的隔離作用，能夠很好的提高蝦青素在光照條件下的穩(wěn)定性，因此在實際應(yīng)用中建議采用微囊粉為原料從而提高產(chǎn)品中蝦青素含量，同時采用避光包裝來保證產(chǎn)品中的蝦青素穩(wěn)定性。

圖4 光照條件下保留率Fig.4 The retention rate of illumination condition

圖5 避光條件下保留率Fig.5 The retention rate of darkness condition

2.2.2 熱穩(wěn)定性

由圖6可以看出，在高溫環(huán)境下不論是藻粉還是微囊粉制備的軟糖其蝦青素保留率均有明顯的下降，經(jīng)過3個月存放蝦青素減少量為7.21%和35.8%，最終保留率為1.48%和31.95%，但微囊粉的穩(wěn)定性依然好于藻粉，由結(jié)果可以看出，蝦青素屬于熱敏感性物質(zhì)，高溫能導(dǎo)致其快速分解，與其熱不穩(wěn)定的性質(zhì)相符，同時可以看出微囊壁能夠?qū)Π趦?nèi)的蝦青素起到一定的保護(hù)作用。因此在實際生產(chǎn)中依然建議使用微囊粉為原料。可以看出在軟糖類產(chǎn)品中，溫度對蝦青素保留率的影響要高于光照的影響，其原因可能是因為構(gòu)成軟糖的膠體能夠阻擋部分光線對蝦青素的影響，但膠體本身就對熱的阻擋效果不佳導(dǎo)致蝦青素分解更多。因此，對于軟糖類產(chǎn)品建議在低溫環(huán)境下進(jìn)行倉儲運輸，以保證產(chǎn)品中蝦青素的穩(wěn)定性。

圖6 40 ℃條件下保留率Fig.6 The retention rate of 40 ℃ condition

2.2.3 氧氣環(huán)境穩(wěn)定性

由圖7、8可以看出，在有氧條件下，蝦青素的保留率會有所減少，最終保留率為1.82%和55.02%，無氧環(huán)境下最終保留率為2.56%和60.68%，與有氧環(huán)境進(jìn)行對比其變化量相差并不很多，其原因可能是因為軟糖膠體對蝦青素起到了包裹隔氧的作用，加之在軟糖加工工程中氧氣會被排出，因此在氧氣環(huán)境對軟糖中蝦青素含量的影響遠(yuǎn)沒有光照和溫度的影響強烈。此外，在實際生產(chǎn)中，真空包裝對軟糖的形態(tài)保持不利，同時會增加生產(chǎn)成本和難度，綜合以上因素，建議實際生產(chǎn)中采用微囊粉為原料，在避光、低溫環(huán)境下保藏軟糖產(chǎn)品即可，無需真空包裝。

圖7 有氧條件下保留率Fig.7 The retention rate of aerobic condition

圖8 無氧條件下保留率Fig.8 The retention rate of anaerobic condition

3 結(jié)論

由結(jié)果可知，在產(chǎn)品完成加工后，其中的蝦青素含量對于理論含量均有明顯的減少，說明軟糖加工工藝對蝦青素具有較強的破壞性。且在產(chǎn)品完成生產(chǎn)以后的加速期內(nèi)，蝦青素的含量依然在持續(xù)的減少。從試驗中可知，對于軟糖類產(chǎn)品，溫度對蝦青素保留率的影響最大，其次是光照，最后是氧氣，同時，相對于普通藻粉，微囊粉能夠很好的提高蝦青素在各種條件下的穩(wěn)定性，選擇微囊粉為原料不僅能夠提供很好的最初蝦青素含量，還能在后續(xù)的貨架期內(nèi)對蝦青素提供持續(xù)的保護(hù)，是一種理想的加工原料。

綜上，選擇微囊粉為原料，采用避光的包裝，同時在低溫環(huán)境下對產(chǎn)品進(jìn)行儲運能夠最大程度的提高產(chǎn)品中蝦青素的保留率。