蜂蜜添加方式對羊酸乳品質及抗氧化活性的影響

王宇翔，張穎，曹煒，李萬華，彭德舉，孫婧

1(西北大學 化工學院，陜西 西安，710069) 2(西北大學 食品科學與工程學院，陜西 西安，710069)3(寶雞眾羊生態牧業有限公司，陜西 寶雞，722400)

發酵乳酸甜可口、營養豐富，具有改善人體腸道菌群、減輕乳糖不耐癥、抗氧化等多種功能，近年來越來越受到消費者的關注和青睞[1-2]。與牛乳相比，羊乳不僅是重要的大宗乳原料，并且易于人體消化吸收，富含核苷酸、表皮細胞生長因子等多種活性成分[3]。而蜂蜜作為一種營養和保健價值極高的天然食品，在抗氧化、潤腸等方面也發揮著重要作用[4-5]。因此，在羊乳中加入蜂蜜可將二者營養和保健功效有機結合，為功能性乳制品開發提供一條新思路。

國內外學者在蜂蜜酸乳研究方面已開展不少工作。ROTAR等[6]研究表明，添加蜂蜜對牛酸乳感官品質、理化性質以及微生物組成有明顯影響。PERNA等[7]在牛乳中分別添加板栗和蘇拉蜂蜜，板栗蜂蜜酸乳呈現更高的抗氧化活性。王然等[8]則分析了酸漿果蜂蜜牛酸乳貯藏過程中抗氧化活性的變化。HATI等[9]發現，在乳中添加適量蜂蜜可提高酸乳發酵過程中乳酸菌的蛋白水解活性，促進功能活性肽釋放。ELENANY[10]則研究了添加不同比例馬郁蘭蜂蜜對羊酸乳感官、流變學及微生物學特性的影響。整體來看，目前相關研究主要集中于蜂蜜牛酸乳，以羊乳為原料非常少；并且添加蜂蜜時，有些將蜂蜜和其他原輔料一起在發酵前配料階段加入，有些則基于保留蜂蜜活性成分考慮于發酵結束后才添加。蜂蜜擁有復雜的天然成分，其是否參與乳酸菌發酵過程對酸乳會產生較大影響。然而，尚未發現蜂蜜不同添加方式對酸乳品質及生物活性影響的研究。我國是世界蜂蜜生產和消費大國，棗花蜜是其中極具特色的大宗單花種蜂蜜，擁有濃郁棗花香氣和特殊口感，同時較油菜、洋槐等淺色蜂蜜具有更強抗氧化活性[11]。目前也尚未見棗花蜜應用于羊酸乳產品開發的報道。

本文以羊乳為研究對象，分別于發酵前和發酵結束后添加棗花蜜，探究棗花蜜不同添加方式對羊酸乳發酵速度、感官品質、乳酸菌數、持水力、質構特性以及抗氧化活性的影響，以期為加快功能性羊酸乳制品開發、促進蜂蜜及羊乳資源利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棗花蜜于2018年采自陜西佳縣，4 ℃貯存待用；生鮮羊乳，寶雞眾羊生態牧業有限公司，驗收合格后4 ℃運至實驗室；YF-L812乳酸菌發酵劑，丹麥科漢森公司。

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、瓊脂粉,北京奧博星生物技術有限責任公司；酚酞,西安化學試劑廠；NaCl、FeSO4，天津市天力化學試劑有限公司；FeCl3、甲醇，天津市科密歐化學試劑有限公司；2, 2-二苯基-1-苦基-肼基(DPPH)、2, 4, 6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、菲洛嗪(Ferrozine),Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250DE數控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；Five Easy Plus pH酸度計，梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-20bR高速低溫冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；722G可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；TA.XTC通用型質構儀，上海保圣實業發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羊酸乳樣品的制備

羊酸乳以及發酵前、后添加棗花蜜的羊酸乳分別按下列工藝流程制備：

(1)羊酸乳(對照)：羊乳→添加白砂糖(質量分數7%)→殺菌(90～95℃/5 min)→冷卻(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌發酵劑(添加量：0.2 U/kg乳)→發酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品

(2)發酵前添加棗花蜜的羊酸乳[以下簡稱棗花蜜羊酸乳(I)]：羊乳→添加白砂糖(質量分數4%)和棗花蜜(質量分數3%)，混合均勻→殺菌(90～95 ℃/5 min)→冷卻(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌發酵劑(添加量：0.2 U/kg乳)→發酵(43 ℃)→后熟24 h(4 ℃)→成品

(3)發酵后添加棗花蜜的羊酸乳[以下簡稱棗花蜜羊酸乳(II)]：羊乳→添加白砂糖(質量分數4%)→殺菌(90～95 ℃/5 min)→冷卻(40 ℃以下)→接入YF-L812乳酸菌發酵劑(添加量：0.2 U/kg乳)→發酵(43 ℃)→冷卻→機械破乳→添加棗花蜜(質量分數3%)并攪拌混勻→后熟24 h(4 ℃)→成品

1.3.2 感官評價

取出羊酸乳樣品，室溫條件放置30 min回溫，然后由10名人員組成評定小組，從色澤、風味、口感、組織狀態4方面對其進行感官評價，評分標準見表1。

1.3.3 滴定酸度測定

參照GB 5413.34—2010中方法[12]測定羊酸乳樣品的滴定酸度。

表1 羊酸乳感官評分表Table 1 Sensory evaluation scale of goat yogurt

1.3.4 乳酸菌數測定

參照GB 4789.35—2016中方法[13]測定保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌活菌數(CFU/mL)，乳酸菌總數為兩者之和。

1.3.5 持水力測定

采用離心法測定酸乳持水力。10 g酸乳樣品于4 ℃條件下分別在4 000 r/min離心20 min、4 500 r/min離心15 min和5 000 r/min離心10 min，離心完畢后棄上清液，對沉淀物稱重。持水力通過公式(1)計算：

(1)

式中，W，樣品持水力，%；m1、m2，分別表示離心前、后樣品質量，g。

1.3.6 質構特性分析

通過反擠壓裝置(TA/BE探頭)對酸乳樣品進行下壓測試，分析其硬度、稠度、黏性指數和內聚性。具體參數如下：探頭直徑40 mm；力量感應元500 g，數據采集頻率10次/s；測試方法：單次測試；測試樣品溫度15 ℃；測前、測中和測后速度分別為0.3、0.3和0.5 mm/s；下壓深度15 mm；最小觸發力3 g。每種樣品平行測定8次，結果以平均值計。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

參照FENG等[14]的方法并略作修改。10 g樣品溶于30 mL甲醇溶液(體積分數80%)，4 ℃下4 000 r/min離心10 min。吸取0.5 mL上清液與4 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/L)混勻，用蒸餾水調至10 mL，于室溫(25 ℃)下避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度，記為A1。乙醇溶液(體積分數95%)代替上清液作為參比，吸光度記為A0。蒸餾水為空白對照，DPPH自由基清除率根據公式(2)計算：

(2)

式中：A0，參比溶液吸光度值；A1，待測樣品溶液吸光度值。

1.3.7.2 總抗氧化能力測定(FRAP法)

參照FENG等[14]的方法并略作修改。酸乳樣品處理同1.3.7.1。吸取0.5 mL上清液與3 mL TPTZ工作液(0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液、10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L FeCl3按體積比10∶1∶1組成)混勻，37 ℃水浴10 min，于593 nm測定吸光度。以蒸餾水為空白對照，FeSO4(0.05～0.3 mmol/L)制作標準曲線，羊酸乳總抗氧化能力以FeSO4當量表示。

1.3.7.3 Fe2+螯合能力測定

參照楊希等[15]的方法并略作修改。10 g樣品溶于30 mL蒸餾水，4 ℃下4 000 r/min離心10 min。吸取4 mL上清液與50 μL FeSO4(2 mmol/L)及0.2 mL Ferrozine(5 mmol/L)混勻，37 ℃水浴30 min，于562 nm測定吸光度，記為A2。蒸餾水代替上清液作為參比，吸光度記為A3。蒸餾水為空白對照，Fe2+螯合率根據公式(3)計算：

(3)

式中：A3,參比溶液吸光度值；A2，待測樣品溶液吸光度。

1.3.8 數據處理與分析

試驗重復3次，數據以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，P<0.05表示存在差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜添加方式對羊酸乳發酵速度的影響

酸乳發酵過程中，乳酸菌利用乳糖產生乳酸等有機酸而使發酵體系酸度升高，實際生產中常通過酸度測定來判斷酸乳是否達到發酵終點，國標要求酸乳產品滴定酸度≥70 °T[16]。如圖1所示，發酵5 h后，發酵前添加棗花蜜的羊酸乳滴定酸度為70 °T，且從外觀上觀察凝乳狀態良好，說明其已達到發酵終點；而此時發酵后添加棗花蜜的羊酸乳和對照羊酸乳僅有60和59 °T，且尚未形成穩固的凝乳體系，繼續發酵至6 h，兩者滴定酸度才分別達到70和69 °T。這表明，發酵前加入棗花蜜有助于加快物料體系的發酵速度，縮短羊酸乳凝乳時間，提高生產效率。蜂蜜中約含有75%～80%還原糖類且主要是葡萄糖和果糖，先添加棗花蜜再進行發酵，乳酸菌不僅代謝乳中乳糖，還可利用蜂蜜中單糖轉化為乳酸，從而促使酸乳酸度升高速度較快[17]。

圖1 棗花蜜添加方式對羊酸乳發酵速度的影響Fig.1 Effect of jujube honey adding methods on fermentationspeed of goat yogurt

2.2 蜂蜜添加方式對羊酸乳感官品質的影響

通過觀察酸乳色澤、風味、口感及組織狀態，評價棗花蜜添加方式對羊酸乳感官品質的影響。如表2所示，與對照羊酸乳相比，發酵后添加棗花蜜的羊酸乳整體感官得分最高，發酵前添加則使產品感官品質略有下降。棗花蜜是一種氣味芳香濃郁的典型琥珀色蜂蜜，2種添加方式均使羊酸乳色澤有所加深，但發酵后添加顯著提高產品最終風味和口感，發酵前添加則導致風味略差。這可能是由于蜂蜜中香氣成分大多為揮發性物質，在高溫時極容易發生損失或破壞，棗花蜜于發酵前添加會參與熱殺菌和發酵過程，原有香氣成分未能得到較好保留[18]。

表2 羊酸乳感官評定結果Table 2 Sensory evaluation results of goat yogurt

注：同一列不同上標字母代表顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 蜂蜜添加方式對羊酸乳乳酸菌數的影響

從表3可以看出，棗花蜜添加方式對羊酸乳中乳酸菌數量有顯著影響，對照羊酸乳的乳酸菌活菌數量最高，棗花蜜羊酸乳(Ⅱ)次之，棗花蜜羊酸乳(I)最低，但3種羊酸乳產品均達到國標要求的乳酸菌總數水平(≥1×106CFU/mL)[16]。棗花蜜于發酵前加入雖促進乳酸菌利用其糖類快速產酸，但蜂蜜中富含的多種天然抗菌成分(包括過氧化氫、甲基乙二醛、酶類、植物源多酚物質、抗菌肽、王漿主蛋白等)會明顯抑制乳酸菌增殖[19-20]，從而導致棗花蜜羊酸乳(I)中乳酸菌數量最低。ROTAR等[6]研究蜂蜜枸杞牛酸乳時，同樣發現發酵前添加蜂蜜導致酸乳中乳酸菌數明顯減少。FENG等[14]研究表明，添加紅棗漿的羊酸乳中乳酸菌數量也顯著降低, 且紅棗漿添加量越大，乳酸菌總數越少，其認為是紅棗漿中各種有機酸及多酚成分抑制乳酸菌生長所致。對于發酵后添加棗花蜜羊酸乳，產品活菌數低于對照羊酸乳，則可能是由于發酵期間可利用糖類含量的減少以及后熟期間蜂蜜對乳酸菌抑制作用等因素導致。另外，無論添加棗花蜜與否，羊酸乳中嗜熱鏈球菌數量均略高于保加利亞乳桿菌(表3)。這與張哲源等[21]研究乳固形物含量對羊酸乳中乳酸菌的影響結果一致，認為可能是由于嗜熱鏈球菌較保加利亞乳桿菌具有更高的蛋白水解活性和乳糖利用率所致。

表3 棗花蜜添加方式對羊酸乳乳酸菌數的影響Table 3 Effect of jujube honey adding methods on thenumber of lactic acid bacteria in goat yogurt

2.4 蜂蜜添加方式對羊酸乳持水力的影響

持水力可衡量酸乳生產和貯藏過程中乳清析出難易程度，是反映發酵乳品質的重要指標。采用不同外力條件比較羊酸乳產品的持水能力，結果如圖2所示。

圖2 棗花蜜添加方式對羊酸乳持水力的影響Fig.2 Effect of jujube honey adding methods on waterholding capacity of goat yogurt

棗花蜜添加與否以及添加方式對羊酸乳持水力有顯著影響，棗花蜜羊酸乳(Ⅱ)表現出最佳持水力，羊酸乳次之，而棗花蜜羊酸乳(I)最差。FENG等[14]研究紅棗羊酸乳時，發現在發酵前加入紅棗漿會導致酸乳產品持水力明顯下降。而在發酵結束后添加棗花蜜，棗花蜜成分可能增強了體系對水分子的結合能力，因而產品持水能力增強。

2.5 蜂蜜添加方式對羊酸乳質構特性的影響

質構儀可客觀評價不同羊酸乳產品的質構學特性差異。如表4所示，硬度、稠度、內聚性和黏性指數4個物性指標高低均為：羊酸乳>棗花蜜羊酸乳(I)>棗花蜜羊酸乳(Ⅱ)。張哲源等[21]研究表明，羊酸乳質構特性與乳固形物含量呈正相關，發酵前添加棗花蜜的羊酸乳體系中固形物濃度較低，因而其硬度、稠度、內聚性和黏性指數均低于對照羊酸乳；而對于發酵后添加棗花蜜羊酸乳，由于發酵完畢后進行了機械破乳操作，凝乳體系被破壞，故各物性指標均最低。張悅等[22]在比較牛、羊酸乳質構特性時也發現，無論對于牛還是羊酸乳，攪拌型產品的質構指標均顯著低于凝固型。

表4 棗花蜜添加方式對羊酸乳質構特性的影響Table 4 Effect of jujube honey adding methods on texture characteristics of goat yogurt

2.6 蜂蜜添加方式對羊酸乳抗氧化活性的影響

在酸乳、奶酪等發酵乳制品生產過程中，乳酸菌水解乳蛋白質釋放各種生物活性肽，從而賦予發酵乳制品功能，如抗氧化生物活性[23-24],如表5所示。

表5 棗花蜜添加方式對羊酸乳抗氧化活性的影響Table 5 Effect of jujube honey adding methods onantioxidant activities of goat yogurt

與對照羊酸乳相比，棗花蜜羊酸乳的DPPH自由基清除率、總抗氧化能力以及Fe2+螯合率均顯著提高(P<0.05)。這可能是由于蜂蜜本身含有豐富的酚酸、黃酮以及類胡蘿卜素等抗氧化組分有關[25]。FENG等[14]和熊笑葦等[26]分別在羊乳中加入紅棗漿和槐米后進行乳酸菌發酵，同樣顯著增強了羊酸乳產品的抗氧化能力。另外，發酵前添加棗花蜜羊酸乳的抗氧化活性明顯高于發酵后添加，尤其Fe2+螯合率增加近40%，這可能與棗花蜜促進酸乳發酵過程中抗氧化成分的釋放有關。此外，前人研究發現，熱處理也會促使蜂蜜產生抗氧化物質，從而增強其抗氧化活性[27-28]，因此，殺菌處理也可能是導致發酵前添加棗花蜜羊酸乳抗氧化活性顯著增強的重要原因。

3 結論

本文研究了發酵前和發酵結束后2種棗花蜜添加方式對羊酸乳發酵速度、感官品質、乳酸菌數、持水力、質構特性以及抗氧化活性的影響。在發酵前加入棗花蜜，有助于乳酸菌產酸從而縮短羊酸乳凝乳時間，但高溫殺菌對蜂蜜香氣成分的破壞會導致整體口感稍差；另外，乳酸菌增殖抑制程度較大，持水力明顯下降，硬度、稠度、內聚性和黏性指數有所降低，抗氧化活性則顯著提高。而在發酵結束后添加棗花蜜，羊酸乳凝乳時間雖無顯著變化，但整體風味、口感以及持水能力得到明顯提高，乳酸菌增殖抑制程度較小，抗氧化活性有所增強，產品硬度、稠度、內聚性和黏性指數則明顯降低。由此可見，蜂蜜的不同添加方式對羊酸乳發酵速度、產品品質以及抗氧化活性具有明顯影響，在開發蜂蜜羊酸乳時，要根據產品需求和目標選擇合適的蜂蜜添加方式及工藝。