羊肚菌多糖純化、結構分析及抗氧化活性

2020-02-27 06:46:10范三紅賈槐旺張錦華任嘉興白寶清

食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年3期

范三紅，賈槐旺，張錦華，任嘉興，白寶清*

1(山西大學生命科學學院，山西太原，030006) 2(特色植物資源研究與利用山西重點實驗室(山西大學)，山西太原，030006)

羊肚菌(Morchellaesculenta)因具有較高的營養(yǎng)價值和獨特的香味，在海內外久享盛譽。據《本草綱目》記載，羊肚菌對胃腸炎癥、消化不良[1]病癥具有良好的治療效果。羊肚菌多糖是羊肚菌的主要成分之一。因其具有抗疲勞[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗菌活性[5]、抑制癌細胞增殖[6]等諸多作用成為研究熱點。

羊肚菌多糖(Morchellaesculentapolysaccharides, MEP)的分離純化與結構分析影響對多糖生物活性的研究。魏蕓等[7]采用DEAE-纖維素離子交換柱及SepharoseCL-6B柱純化羊肚菌菌絲體得到單一多糖MEP-SP1，并得出其主要由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖4種單糖組成。明建等[8]利用DEAE-52纖維素柱層析Sephadex G-100 凝膠色譜純化羊肚菌多糖，得到均一組分PMEP-1，并推測出其結構中含有吡喃環(huán)。孫玉軍等[9]從羊肚菌菌絲體中分離出組分MEP-II，測出分子質量為2.8×104Da。

山西省羊肚菌資源豐富，本實驗以安澤縣褐赭羊肚菌子[10]實體為原料，利用超聲波輔助酶法提取羊肚菌多糖，脫蛋白、脫色，通過DEAE-52纖維素柱和SephadexG-100凝膠柱層析純化，利用紫外光譜法、紅外光譜法、液相色譜法對2種組分進行純度鑒定、光譜特征、單糖組成等基本特征研究，并進行抗氧化實驗，旨在為更好地開發(fā)和利用羊肚菌的多糖組分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌子實體購于山西省安澤縣惠原科貿有限公司，經山西大學生命科學學院韓建榮教授鑒定為褐赭羊肚菌 (Morchellaumbrina)；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA),北京百靈威科技有限公司；乙腈 (色譜純),Ther-moFisher公司；右旋糖酐標準品、纖維素酶,美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀,美國安捷倫公司；UV-1801紫外分光光度計,北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；FD-1D-50冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；SC-3614離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司；SP-2000UV型紫外分光光度計,上海光譜儀器有限公司；AL204 電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司；72-1電熱恒溫干燥箱,湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；Thermo Scientific Nicolet iS50紅外光譜儀,美國Thermo Fisher公司；AFM Multimode8,美國Bruker公司；JSM-6701F掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM),日本電子公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗多糖提取

羊肚菌粗多糖的提取參考課題組已有的方法[11]：羊肚菌子實體→干燥 (40 ℃、6 h) →粉碎過80目篩 →酶解→超聲波提取→滅酶 (95 ℃、15 min) →離心 (4 500 r/min、15 min) →取上清液→濃縮→4倍體積無水乙醇醇沉過夜→離心 (4 500 r/min、15 min) →沉淀溶解(蒸餾水)→定容→TCA法脫蛋白→H2O2法脫色素→MEP。

1.3.2 分離純化

1.3.2.1 DEAE-52 柱層析

用Tris-HCl溶液將DEAE-52纖維素層析柱(2.6 cm×30 cm)平衡12 h，將羊肚菌粗多糖配制成5 mg/mL 的溶液，上樣量2 mL，流速2.5 mL/min，分別用Tris-HCl、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L 的NaCl 溶液進行梯度洗脫[12]，每2 min收集1管，采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中多糖含量，以每管洗脫液吸光度為縱坐標，合并相同組分的收集液，濃縮，透析，凍干。

1.3.2.2 Sephadex G-100 柱層析

將DEAE-52 柱層析收集的凍干組分配制成5 mg/mL的多糖溶液，上樣2 mL，Sephadex G-100 柱層析洗脫液為0.1 mol/L NaCl，流速為0.5 mL/min，每5 min收集1管[13]，采用苯酚-硫酸法測定洗脫液中多糖含量，以每管洗脫液吸光度為縱坐標，以收集管數為橫坐標繪制洗脫曲線收集主峰的洗脫液，濃縮，透析，凍干。

1.3.3 羊肚菌多糖結構鑒定

1.3.3.1 羊肚菌多糖紫外光譜分析

利用紫外分光光度計在190～400 nm 范圍內掃描，掃描間距為1 nm，觀察在280和260 nm處是否有明顯的吸收峰。

1.3.3.2 羊肚菌多糖紅外光譜分析

稱取經真空冷凍干燥后的羊肚菌多糖組分MEP-2、MEP-3各5 mg 置于紅外光譜儀樣品臺上，固定樣品，用紅外光譜儀7 800～350 cm-1掃描。

1.3.3.3 羊肚菌多糖分子質量測定

根據文獻[14]報道的方法，采用HPGPC法測定多糖的平均相對分子質量。色譜條件：色譜柱：TSKgel GMPWXL(7.8 mm×300 mm，5 μm)，檢測器：示差折光檢測器，SHODEX Rl-201H，柱溫箱HT-330，柱溫：35 ℃，進樣量：20 μL上樣濃度：5 mg/mL，洗脫液：去離子水，流速：0.5 mL/min。用已知分子質量的右旋糖酐做標準品，以色譜峰的保留時間(Rt)，右旋糖苷葡聚糖標準品 (T-180, T-2000, T-4600, T-7100, T-10,000, T-21,400, T-84,400, T-133,800, 和T-2,000,000) 的平均分子質量的對數值 (logMw) 制作標準曲線，標準曲線方程為lgMW=-0.480 3Rt+12.798，R2=0.989 1。

1.3.3.4 羊肚菌多糖單糖組成分析

單糖組成分析用 PMP 柱前衍生化單糖，經高效液相色譜分離鑒定，具體試驗操作參考文獻[15]并做適當的修改。多糖樣品5 mg，加入5 mL 4 mol/L TFA，置于樣品瓶中，生料帶封口，110 ℃ 水解4 h，冷卻至室溫，加入甲醇，真空干燥3次。取400 μL單糖混樣加入4 500 μL 0.3 mol/L NaOH、450 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液中，混勻，70 ℃衍生2 h，冷卻至室溫，加入450 μL 0.3 mol/L HCl 中和，加入1 mL氯仿，充分振蕩，棄去有機相，重復萃取3次，過0.45 μm 膜，置于樣品瓶，待上樣。

HPLC條件：流速 1.0mL/min，上樣體積：10 μL，檢測波長 250 nm，柱溫：40 ℃，洗脫液：流動相 A(乙腈)∶流動相 B(0.06 mol/L 磷酸緩沖液)=16∶84(體積比)。

1.3.3.5 羊肚菌多糖三螺旋結構分析

將多糖樣品配制成2 mg/mL，加入等體積的0.2 mmol/L的剛果紅溶液與NaOH溶液，混合均勻，使NaOH的最終摩爾濃度由 0～0. 4 mol/L等梯度增加[16]，室溫靜置5 min，測定最大吸收波長的變化。

1.3.3.6 羊肚菌多糖表觀形貌觀察

將羊肚菌組分MEP-2、MEP-3經過冷凍干燥制成白色絮狀物，挑取適量黏到銅質樣品臺，表面噴金，用掃描電鏡觀察多糖外部結構。

1.3.3.7 羊肚菌多糖分子形貌觀察

稱取羊肚菌組分MEP-2、MEP-3各1 mg溶解于10 mL 蒸餾水中，稀釋到最終質量濃度為10 μg/L，用 0.45 μm 濾膜過濾，取40 μL 滴在云母片上，自然干燥。用雙面膠將云母片固定在樣品臺上，用原子力顯微鏡(atomic foree microscope, AFM)觀測多糖分子形貌。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 清除DPPH自由基能力測定

參考MA等[17]的方法并加以改動，樣品組(A1)為2 mL DPPH試劑與2 mL多糖樣品，空白組(A0)用水代替樣品，對照組(A2)用無水乙醇代替DPPH試劑，Vc 為陽性對照。

1.3.4.2 清除·OH能力測定

采用水楊酸法[18]測定羊肚菌多糖對羥自由基的清除能力，在試管中依次加入 9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、不同濃度多糖溶液1 mL 以及 30%的 H2O2溶液 1.0 mL，靜置 30 min，510 nm 波長處測定吸光度。對照組(A2)用蒸餾水代替H2O2，空白組(A0)用蒸餾水代替樣品，Vc 為陽性對照。

采用文獻[19]方法測定超氧陰離子清除率，取 4.5 mL Tris-HCl緩沖液，加入 2.4 mL 蒸餾水及多糖溶液1 mL，混勻，25 ℃水浴 10 min，再加入 0.1 mL 鄰苯三酚，搖勻，25 ℃ 水浴 3 min，加入 0.5 mL 0.1 mol/L HCl，320 nm 處測定吸光度(A1)，對照組(A2)用蒸餾水代替鄰苯三酚，空白組(A0)用蒸餾水代替樣品，VC作為陽性對照。

1.3.4.4 清除ABTS·能力測定

采用謝惠等[20]的方法測定清除ABTS自由基的能力，樣品組(A1)為3.9 mL ABTS試劑與0.1 mL樣品，空白組(A0)用水代替樣品，對照組(A2)用95%乙醇代替ABTS試劑，VC作為陽性對照。

1.3.4.5 還原力測定

采用普魯士藍顯色法[21]測定MEP的還原力，取不同濃度多糖溶液 1.0 mL于試管中，加入 0.2 mol/L 磷酸緩沖液、2.0 mL K3(Fe(CN)6)，50 ℃水浴 30 min，冷卻，加入 2.0 mL TFA。吸取反應液 2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水、0.4 mL FeCl3溶液，混勻，暗室反應 30 min，700 nm處測定吸光度，Vc 為陽性對照。

1.3.4.6 清除率

清除率按公式(1)計算：

(1)

2 結果與分析

2.1 羊肚菌粗多糖的分離純化

2.1.1 羊肚菌多糖DEAE-52柱層析

羊肚菌粗多糖經過脫蛋白、脫色后得率為7.79%。采用DEAE-52纖維素柱對羊肚菌粗多糖進行純化，得到3個組分MEP-1、MEP-2和MEP-3(如圖1所示)。因MEP-1含量較少，將組分MEP-2和MEP-3透析，干燥，進一步純化。

圖1 羊肚菌多糖DEAE-52 色譜柱洗脫曲線Fig.1 Elution curves of Morchella esculenta polysaccharideson DEAE-52 cellulose column注：MEP-1、MEP-2和MEP-3分別為DEAE-52色譜柱洗脫后3個組分

2.1.2 羊肚菌多糖Sephadex G-100色譜柱進一步純化

利用Sephadex G-100色譜柱對初步純化的羊肚菌多糖MEP-2和MEP-3組分進一步純化(如圖2所示)。

圖2 羊肚菌多糖Sephadex G-100色譜柱洗脫曲線Fig.2 Elution curve of Morchella esculenta polysaccharideson Sephadex G-100 colum

由圖2可知，經過Sephadex G-100凝膠色譜柱進一步分離純化得到的2個組分均為單一洗脫對稱峰，證明所得的羊肚菌多糖為較純均一多糖，收集2組組分液，透析、干燥，得到羊肚菌多糖純品MEP-2和MEP-3。

2.2 羊肚菌多糖結構鑒定

2.2.1 羊肚菌多糖紫外光譜分析

由圖3可知，羊肚菌純化組分MEP-2、MEP-3在紫外掃描范圍內均無吸收峰，表明經過分離純化后得到的MEP-2、MEP-3樣品中均不含有核酸或蛋白質等物質。

圖3 羊肚菌多糖紫外-可見光譜掃描圖Fig.3 UV-vis spectrum of Morchella esculenta polysaccharides

2.2.2 羊肚菌多糖的紅外光譜分析

MEP紅外光譜如圖4所示。

圖4 羊肚菌多糖紅外光譜掃描圖Fig.4 FT-IR spectrum of Morchella esculentapolysaccharides

2.2.3 MEP的分子量測定

由圖5可知，經HPGPC檢測，羊肚菌多糖2個組分MEP-2和MEP-3的洗脫峰單一且較為對稱，這說明2個組分純度相對較高。羊肚菌多糖MEP-2、MEP-3兩組分的保留時間分別為18.482、18.182 min，通過線性回歸方程計算，得到它們的分子質量分別為8.3和11.6 kDa。

a-MEP-2;b-MEP-3圖5 羊肚菌多糖HPGPC色譜圖Fig.5 HPGPC chromatograms of Morchella esculentapolysaccharides

如圖6所示，MEP-2是由D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖組成，摩爾比為2.97∶13.69∶1∶2.60；MEP-3的單糖組成為D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖，摩爾比為18.25∶0.84∶1∶1.53。

a-標準單糖；b-MEP-2；c-MEP-3;1-D-甘露糖；2-L-鼠李糖；3-D-葡萄糖；4-D-半乳糖；5-D-木糖；6-D-阿拉伯糖圖6 標準單糖、MEP-2、MEP-3高效液相色譜圖Fig.6 HPLC of mixed standard monosaccharides,MEP-2 and MEP-3

2.2.5 MEP三螺旋結構分析

由圖7可知，隨著NaOH濃度的增加，MEP-2與剛果紅反應形成的絡合物的最大吸收波長是先增加后降低的。在弱堿性條件下，即NaOH溶液摩爾濃度在0～0.06 mol/L區(qū)間內逐漸增大時，溶液的最大吸收波長也隨之逐漸增大；隨著溶液堿性的逐漸增大，最大吸收波長基本呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，可能是因為多糖之間的氫鍵在堿性條件下被破壞[25]，因此可以推斷，MEP-2具有三股螺旋結構。MEP-3無此現(xiàn)象，可以證明MEP-3無雙螺旋結構。

圖7 不同摩爾濃度NaOH剛果紅試劑與多糖混合液 λmax變化圖Fig.7 Changes in absorption wavelength maximum ofmixture of congo red and polysaccharides at variousconcentrations of NaOH

2.2.6 MEP表觀形貌分析

如圖8所示，在放大500倍時MEP表面光滑，呈現(xiàn)不規(guī)則的網狀結構，物質間相互作用強，緊密結合，MEP-2呈現(xiàn)不同大小的球形構象，MEP-3主要為球狀和片狀，碎片大小不一。放大1 000倍下觀察發(fā)現(xiàn)，MEP部分網狀結構有小的間隙。MEP-2晶體間有非常微小的空隙，使得多糖并未完全集合,這說明多糖分子間存在相互排斥力，分子間吸引力較為弱小[26]。MEP-3具有一面光滑，一面粗糙的形貌。

a-MEP×500;b-MEP×1 000;c-MEP-2×500;d-MEP-2×1 000;e-MEP-3×500;e-MEP-3×1 000圖8 羊肚菌多糖掃描電鏡觀察外部形貌Fig.8 Observation of the polysaeeharides fromMorchella eseulenta

2.2.7 MEP分子形貌分析

MEP的原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)圖像如圖9所示，掃描范圍為2 μm×2 μm，由圖9可知，MEP-2聚集體呈鏈狀與帶有裂紋球形體，鏈高0.53～1.34 nm，鏈寬40.16～98.62 nm；球形體直徑約為50.46～100.02 nm；MEP-3呈現(xiàn)球狀，球形體直徑約為60.52～104.62 nm，高度在1.62～4.86 nm。