不同曲層中高溫大曲質量差異性研究

彭璐，明紅梅*，董異，王小軍，王軒，陶敏，曾茂闖

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000) 2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)

大曲是以小麥(或配有大麥、豌豆)為主要原料，自然接種網羅環境微生物，在人工控制的溫度和濕度下培育而成[1]。大曲富含多種微生物、酶類、復合香氣成分，對白酒品質有重要貢獻[2]。隨著大曲生產規模不斷擴大，傳統單層曲坯制曲模式滿足不了生產需求，已逐步發展成多層曲坯立體制曲模式[3]。這種制曲模式雖滿足了生產需求，但不同坯層間存在微環境(溫度、氧氣含量、濕度等)的差異，導致大曲質量有一定差異，不利于實現標準化制曲。目前，立體制曲的研究主要針對不同樓層大曲、曲塊部位的相關指標差異性分析。明紅梅等[4]對低溫季節樓盤式制曲研究發現，大曲微生物分布受到立體空間、大曲品溫、室溫等環境因素的影響；楊勇等[5]研究表明，中高溫成品曲曲心的酯化力、酸性蛋白酶活力最高，曲皮微生物數量、糖化力、發酵力最高；李登勇等[6]研究表明，高溫大曲曲表酸度、酯化力比曲心高，但曲心水分、總揮發性物質含量及種類多于曲表。綜上所述，目前針對不同曲層大曲質量的差異及其與微環境的相關性研究報道較少。

大曲的制作經過發酵和貯存兩個時期[7]。研究以秋季安曲的中高溫成品大曲為研究對象，對不同曲層大曲的理化生化指標、感官評分、微生物數量、特征風味物質進行對比分析，探究不同曲層中高溫成品大曲質量的差異性，以及貯存期的微環境對大曲質量的影響，為今后改進制曲工藝，提升大曲品質奠定基礎，進一步推動制曲生產的規范化、標準化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

中高溫成品大曲，從安曲到出庫時間總計90 d，其中貯存期為60 d，由四川某著名白酒生產企業提供。

1.1.2 主要儀器與設備

DHG-9023A電熱干燥箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；LRH-250生化培養箱，上海合恒儀器設備有限公司；固相微萃取裝置，美國Supelco公司；TRACE 1300氣相色譜-質譜聯用儀，美國Thermo公司；固相微萃取頭(2cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法及樣品前處理

隨機選3個不同曲庫，每個庫房各選不同曲層的大曲，根據曲塊在貯存期貯存位置的不同，分為底層、中下層、中層、中上層、頂層樣本。采用五點取樣法在每個曲層的四角和中心位置各選取1塊大曲。將整塊大曲粉碎過20目篩，各曲粉混勻后采用四分法濃縮至200 g作為1個樣本，共30個樣本，4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 大曲感官評定方法

10位制曲生產經驗豐富的工作人員，參考文獻[8]通過外表、斷面、皮張、香味進行評價打分，詳見表1。

表1 大曲感官評分標準表Table 1 Sensory scoring standard of Daqu

注：總分為60分

1.2.3 大曲理化生化指標檢測及微生物計數

水分、酸度、酯化力、氨基酸態氮、酒化力檢測方法參考文獻[9]；微生物(霉菌、酵母、芽孢桿菌)計數參考文獻[4]。

1.2.4 大曲揮發性物質的檢測方法

取1.2.1樣品研磨后過40目篩，將3 g樣品加入20 mL頂空瓶，加內標2-辛醇30 μL，60 ℃平衡20 min, 萃取吸附30 min[10]，升溫程序參考文獻[10]。

1.2.5 揮發性風味物質的定性與半定量

定性：檢出揮發性風味物質的質譜圖，通過與標準譜庫對比鑒定，選取匹配度大于90%[11]的揮發性物質。

半定量：采用頂空固相微萃取結合氣質聯用方法，內標2-辛醇半定量，化合物質量濃度為內標物質量濃度與化合物、內標物峰面積比值的乘積[7]。

1.2.6 氣味活度值法分析大曲風味物質

氣味活度值(odor activity value，OAV)即物質質量濃度與香氣閾值之比，表示大曲中各香氣化合物對整體香氣成分的貢獻，當 OAV>1時，認為該風味物質對樣品香氣有貢獻，且OAV 越大，表明該風味物質貢獻越大[12-13]。

1.2.7 數據處理

采用Spss 20軟件單因素方差和主成分分析，Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 大曲的理化生化指標值及感官評分差異性分析

大曲理化生化指標及大曲的外觀、香味等反映大曲質量，檢測樣品的理化生化指標并進行感官評價后，做單因素方差分析，結果見表2。大曲微生物總數及各類微生物相對百分比見圖1。

表2 不同曲層大曲理化生化指標值及感官評分Table 2 Biochemical index values and sensory scores of different curved layers

注：所有理化生化指標以絕干計。感官評分換算成100分制。同列標注的不同字母表示差異性顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

圖1 大曲微生物總數及各類微生物相對百分比Fig.1 The total number of microorganisms in Daquand the relative percentage of various microorganisms

大曲酸度主要是產酸菌的有機酸代謝，脂肪、淀粉等的降解[14]，酒化力是大曲液化力、糖化力和微生物產酒能力的綜合評價[8]。由表2可知，酸度、酒化力值，感官評分在各曲層間均差異不顯著，可能是各曲層微環境的差異對于產酸和產酒等微生物的繁殖與代謝及感官評分沒有明顯影響。

由表2可知，酯化力，水分、氨基酸態氮含量在部分曲層差異顯著。底層水分與中上層差異顯著，底層水分最高(13.29%)，可能是大曲在貯存過程中，水分受重力影響向下沉積，且底層溫度相對較低，水分不易揮發。頂層氨基酸態氮含量與中下層、底層差異顯著。大曲中游離氨基酸主要是原料中蛋白質的降解轉化[15]，與產蛋白酶微生物有關。頂層氧氣充足，可能有利于產蛋白酶的芽孢桿菌與霉菌繁殖代謝。由圖1知，頂層霉菌數比其余各曲層高[數量級約106CFU/g(曲)]，頂層霉菌和芽孢桿菌數量總和比中下層、底層霉菌和芽孢桿菌數量總和均值高60.82%。中層及以上曲層的酯化力值與中下層、底層差異顯著。大曲酯化力是評價微生物代謝己酸乙酯酯酶的活力，其優勢微生物是霉菌和酵母[16-17]，中層及以上曲層溫度較高、氧氣較充足，有利于酵母和霉菌富集。頂層酵母數(數量級約104CFU/g·曲)比底層酵母數高22.80%。且各曲層的酵母、霉菌總數均值比較，中層及以上曲層微生物總數比中下層、底層微生物總數高50.19%，從而導致大曲酯化力值差異。

2.2 不同曲層大曲的特征風味物質含量差異性分析

大曲風味物質是白酒香氣的重要來源[18]。對樣本進行揮發性物質檢測，結合文獻[7,10,19-22]中報道的風味物質，共確定42種大曲風味物質。其中酯類18種、醛酮類5種、醇類1種、芳香類6種、烷烯類9種、吡嗪類3種。酯類占總風味物質的質量百分比最大，為74.50%。經分析，中上層大曲風味物質種類數和總含量均較多，其揮發性成分總離子流圖見圖2。

圖2 中上層大曲揮發性成分總離子流圖Fig.2 Middle-upper Daqu volatile componenttotal ion current map

大曲中特征風味物質是大曲的關鍵性香氣成分。OAV值越大，對整體香氣貢獻越大[13]，以各曲層風味物質平均含量計算OAV值，得OAV值>1有辛酸乙酯、正己酸乙酯、十六酸乙酯、β-石竹烯，并結合文獻[7,10,19-24]中報道的大曲主要風味物質：9-十六碳烯

酸乙酯、十二酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、十四酸乙酯、亞油酸乙酯、壬酸乙酯、十五酸乙酯、苯乙醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪，共選擇出15種特征風味物質。

為比較各曲層15種特征風味物質含量的差異，進行單因素方差分析，結果見表3。

由表3可知，中上層大曲亞油酸乙酯含量與頂層差異顯著，中上層亞油酸乙酯含量最高，為1 567.25 μg/kg。有研究表明，溫度能促進長鏈酯類化合物的形成[24]，中上層溫度較高，可能有利于亞油酸乙酯的生成。其次，長鏈酯類的合成還與某些酵母有關[27]，還待進一步研究。頂層亞油酸乙酯含量最低為79.25 μg/kg。亞油酸乙酯活潑不穩定，頂層氧氣較充足，可能促進亞油酸乙酯氧化分解為醛、羧酸等復雜混合物[28]。除亞油酸乙酯以外的14種特征風味物質含量在各曲層間均不顯著差異。張春林等[7]報道，中高溫大曲在培菌階段的總體風味物質含量已達到較高值。結合生產實踐，隨機翻曲后，可能對大曲的質量起到均質作用。貯存期各曲層間的濕度、溫度、氧氣等微環境及微生物分布的不同，并沒有導致各曲層特征風味物質含量明顯的差異。

表3 不同曲層大曲特征風味物質的含量Table 3 Content of flavor substances in different curved layers

注：表中化合物的閾值為在水中的閾值，“-”表示無法查到該化合物在水中的閾值。同行標注的不同字母表示差異性顯著(P<0.05)，同行標注的相同字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.2.1 酯類物質比較分析

由表3可知，中上層與中下層大曲比較，酯類物質中十六酸乙酯含量差值最大(942.69 μg/kg)。酯類物質的合成與有些芽孢桿菌相關[29]。

底層與頂層大曲比較，酯類物質中亞油酸乙酯含量差值最大(727.29 μg/kg)。底層芽孢桿菌較為豐富略低于中上層(數量級約106CFU/g·曲)，底層芽孢桿菌數比頂層高146.34%，可能是底層水分含量較多，有利于某些芽孢桿菌繁殖，從而促進酯類物質生成[29]。

2.2.2 芳香類物質及萜烯物質比較分析

由表3知，中上層與中下層比較，苯乙醇含量差值為122.09 μg/kg。苯乙醇的生成代謝主要與苯丙氨酸代謝相關[12,30]。中上層溫度較高、氧氣較充足，可能有利于一些酵母及芽孢桿菌繁殖代謝[30-31]，促進苯乙醇生成。

底層與頂層比較，苯乙醇含量差值為215.62 μg/kg。底層芽孢桿菌數量較多，一些芽孢桿菌具有產蛋白酶的能力[31]，從而促進苯乙醇生成。

中上層β-石竹烯含量比中下層更高，其差值為64.33 μg/kg；頂層β-石竹烯含量比底層略高。研究發現，萜烯類物質生成與某些酵母[32]和霉菌[33-34]有關。頂層、中上層氧氣較充足，有利于富集好氣性酵母和霉菌，可能有利于β-石竹烯生成，還待進一步研究。

2.2.3 吡嗪類物質比較分析

吡嗪類物質的形成與微生物酶和美拉德反應有關[35]。由表3知，中上層與中下層比較，2,3,5,6-四甲基吡嗪含量差值為54.89 μg/kg。中上層芽孢桿菌數最高，一些產蛋白酶的芽孢桿菌代謝產生氨基酸等物質，促進吡嗪類產生。

底層與頂層比較，2,3,5,6-四甲基吡嗪含量差值為113.50 μg/kg。底層芽孢桿菌數較多，經芽孢桿菌蛋白酶作用，產生大量氨基酸等物質，有利于吡嗪類物質的生成。除此以外，頂層大曲特征風味物質含量較少，可能還與自然揮發有關。

2.3 不同曲層大曲質量比較

2.3.1 不同曲層大曲理化生化指標、感官評分主成分及聚類分析

沈才洪等[8]在大曲傳統評體系基礎上，引入了生香力、酒化力，將理化指標和感官評分作為靜態因子，生化指標作為動態因子。因此將各曲層理化生化指標值、感官評分進行主成分分析，提取2個主成分，累計貢獻率達到87.14%，說明這2個主成分能夠反映樣本信息量。建立大曲綜合得分F的數學模型：F=0.79F1+0.21F2，分析結果見表4。繪制不同曲層大曲質量評價指標主成分散點圖，見圖3。

由表4、圖3可知，中上層綜合得分最高，底層和中下層綜合得分較低。中層和頂層聚為一簇，中上層、底層、中下層分別單獨一簇。因此，大曲質量可分為4個不同的類別。

表4 不同曲層大曲質量的主成分分析Table 4 Principal component analysis of Daququality of different curved layers

圖3 不同曲層大曲的質量主成分散點圖Fig.3 The main quality of the different curved layers of Daqu

2.3.2 不同曲層大曲特征風味物質主成分及聚類分析

隨著分析技術的進步，大曲香氣評價逐步進入大曲質量體系[10]。將各曲層的15種特征風味物質含量數據進行主成分分析，提取3個主成分，累計貢獻率達到93.16%，說明這3個主成分能夠反映樣本信息量。建立大曲特征風味含量綜合得分F的數學模型：F=0.53F1+0.31F2+0.16F3，分析結果見表5。繪制不同曲層特征風味物質主成分散點圖，見圖4。

表5 特征風味物質主成分得分及綜合得分Table 5 Main component score and comprehensivescore of characteristic flavor substances

圖4 不同曲層大曲特征風味物質主成分散點圖Fig.4 Dispersion point map of flavor material in differentcurved layers

由表5、圖4可知，中上層綜合得分最高，中下層和頂層綜合得分較低。中上層、中層分別單獨聚為一簇，頂層、中下層、底層因距離較近，則聚為一簇。因此，大曲品質可分為3個不同類別。

結合2.3分析，中上層大曲質量最優。從理化生化指標、感官評分來評價，底層和中下層大曲品質較差；從特征風味物質含量來評價，中下層和頂層大曲品質較差。基于各曲層的理化生化指標值、感官評分的差異更為顯著。因此，大曲質量評價應以理化生化指標、感官評分為主要，特征風味物質含量為輔助。

3 結論

經過對各曲層理化生化指標、感官評分的分析，底層大曲水分含量與中上層差異顯著；頂層大曲的氨態氮含量與中下層、底層差異顯著；中層及以上曲層酯化力值與中下層、底層差異顯著。對大曲的15種特征風味物質含量比較分析，中上層大曲亞油酸乙酯含量與頂層差異顯著。

綜合大曲的理化生化指標、感官評分和特征風味物質含量評價，中上層大曲質量為最優。從理化生化指標、感官評分來分析，底層和中下層大曲品質較差；從特征風味物質含量來分析，中下層和頂層大曲品質較差。因此，建議不同曲層配合使用，并對制曲工藝進行改進，如頂層大曲根據溫度變化適當加強草簾覆蓋，防止風味物質揮發；底層大曲可加強保溫，防止曲蟲的破壞等。

大曲風味物質的變化與微環境差異和微生物分布不同的關聯，以及結合高通量測序技術分析大曲中微生物群落結構，更深入地揭示大曲風味物質與微生物之間的關系，還有待后續研究。本研究受到樣品季節和數量的局限、已定性風味物質的數據庫的限制等因素的影響，以及大曲特征風味物質的確定，還有待深入研究。本研究結果為大曲質量的優化和制曲工藝的改進提供了依據，從而促進制曲生產標準化、規模化發展，有利于白酒生產企業的可持續健康發展。