四川傳統臘肉中微生物群落結構研究

文開勇，汪月，文鵬程，朱艷，楊敏，張忠明，張衛兵*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州，730070)

四川臘肉是以屠宰后的鮮豬肉為主要原料，用食鹽等腌制后，經烘烤、煙熏而成的傳統發酵肉制品，因其獨有的風味、鮮明的色澤和濃郁的香氣，受到廣大人民的喜愛[1-3]。在制作與貯藏過程中，微生物作用于臘肉中的蛋白質和脂肪等營養物質，形成了臘肉良好的色澤和風味[4-5]。由于臘肉加工環境相對開放，多種微生物參與了臘肉的成熟過程。

目前關于臘肉中微生物的報道較多。全拓等[6]研究川味臘肉貨架期間的主要微生物，得出優勢菌是葡萄球菌和微球菌，其次是乳酸菌；劉有晴等[7]采用可培養方法，對農家自制四川臘肉中乳酸菌進行分離篩選，獲得1株植物乳桿菌；于華等[8]以四川臘肉為研究對象，采用平皿生化法對其高產脂肪酶的霉菌進行分離篩選，獲得1株團青霉(Penicilliumcommune)；田園園等[9]從四川省眉山等5市的傳統腌臘肉樣品中篩選出8株乳酸菌；陳競適等[10]以湘西花垣縣和鳳凰縣農戶陳年臘肉為原料，研究得出酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；馮秀娟等[11]研究了湖南懷化地區傳統臘肉，得出優勢菌為乳酸菌和葡萄球菌；李福榮等[12]對信陽傳統發酵臘肉中的細菌進行研究，得出優勢菌為葡萄球菌和微球菌；畢旺來等[13]對湖北省神農架林區的臘肉進行研究，得出主要微生物為葡萄球菌。不同地區臘肉的微生物多樣性存在差異，以上研究均以傳統培養法為基礎的微生物學手段進行分析，該方法的缺陷是不能全面、準確地反映樣品的微生物信息[14]；新興的Illumina高通量測序技術具有操作簡單、成本較低、結果可信度高等優勢[15]。因此，通過Illumina高通量測序技術能夠全面而準確地了解研究對象中微生物種類組成和結構。

本研究運用Illumina高通量測序技術對采自四川省達州市的臘肉樣品中微生物多樣性進行分析，以期全面地解析臘肉中的微生物組成及群落結構，為四川傳統臘肉的加工及品質控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.Z.N.A.Soil DNA kit D5626-01試劑盒，美國OMEGA公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，美國Invitrogen公司；Q5高保真DNA聚合酶，美國New England Biolabs公司；凝膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Pico-21型臺式離心機，Thermo Fisher；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統，美國UVP公司；Q32866型Qubit 2.0分光光度計，Invitrogen公司；T100TM Thermal Cyeler型PCR儀，BIO-RAD公司；MiSeq System SY-410-1003高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集

2019年3月于四川省達州地區采集6份臘肉樣品(編號分別為M1、M2、M3、M4、M5、M6)，將所有樣品裝入自封袋，置于冷藏箱中運至實驗室以備試驗。

1.3.2 臘肉微生物總DNA的提取

臘肉樣品中微生物總DNA提取選用E.Z.N.A.Soil DNA Kit D5625-01試劑盒，按照使用說明從樣品中提取DNA；然后使用 Qubit 2.0 分光光度計定量提取的 DNA，并通過 0.8%瓊脂糖凝膠電泳確定 DNA 提取的完整性。

1.3.3 PCR擴增及測序

以稀釋后的基因組總 DNA 為模板，靶向擴增 16S rRNA的 V3-V4區，擴增引物分別為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)。選用真菌特異性引物對ITS區域進行擴增，擴增引物分別為ITS5F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和ITS1R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR條件如下：預變性為95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共25個循環，72 ℃退火10 min，最后保存在4 ℃條件下。選用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，然后用試劑盒回收并進行質量檢測并建庫。最后由上海派森諾生物科技股份有限公司在MiSeq測序平臺進行雙端測序。

1.3.4 高通量測序數據處理

MiSeq測序得到的數據選用Mothur(V.1.31.2)和QIIME(V.1.7.0)軟件進行處理及分析[16-17]。首先選用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一進行質量篩選，然后利用FLASH軟件(v1.2.7)對質量初篩的雙端序列進行配對連接,最后將連接后的序列識別分配對應樣本，從而獲得有效序列。在測序過程中會產生一些錯誤或疑問序列，因此選用QIIME軟件(v1.8.0)[18]識別疑問序列。隨后調用USEARCH(v5.2.236)檢查并剔除嵌合體序列[19-22]。最后，調用UCLUST算法進行序列聚類，以97%的序列相似度進行歸并和(operational taxonomic units，OTU)[23]劃分。

采用Mothur(V.1.31.2)軟件進行群落結構的Alpha多樣性分析。

1.4 數據分析

采用Excel 2010和Origin 2018軟件進行處理分析并作圖。

2 結果分析

2.1 四川傳統臘肉樣品中Alpha多樣性分析

臘肉樣品中細菌和真菌的測序結果及Alpha多樣性指數如表1所示。通過細菌16S rRNA 的V3-V4區進行測序，6份樣品共產生高質量序列190 673條，將所有序列按97%的相似度進行OTU聚類，得到7014個OTU；通過真菌ITS區測序，6份樣品共產生高質量序列213 533條，聚類后得到1 812個OTU。

表1 測序結果及Alpha多樣性指數表Table 1 Sequencing results and Alpha diversity index

注：表中M1-B到M6-B為樣品細菌的Alpha多樣性指數，B-mean為細菌樣品的Alpha多樣性指數的平均值；M1-F到M6-F為細菌樣品的Alpha多樣性指數，F-mean為樣品真菌的Alpha多樣性指數的平均值

Shannon指數是衡量物種多樣性的指數，Shannon指數值越高，物種多樣性越豐富，反之,物種多樣性越少。6份樣品中細菌的Shannon指數在2.85～6.80之間，最高的為樣品M6-B(6.80)，表明M6-B中細菌OTU的多樣性較高；Shannon指數最低的為樣品M5-B(2.85)，反映了M5-B中細菌多樣性較低；6份樣品中真菌的Shannon指數在0.67～2.18之間，最高的為樣品M5-F(2.18)，表明M5-F真菌OTU的多樣性較高；Shannon指數最低的為樣品M4-F(0.67)，反映了M4-F的真菌多樣性較低。

Chao1指數和ACE指數主要體現稀有群落的豐富度。Chao1指數或ACE指數越大，表明群落的豐富度越高。6份樣品中細菌的Chao1指數在367.30～901.96之間，ACE指數在373.56～974.03之間；樣品M2-B的Chao1指數和ACE指數最高，分別為901.96和974.03，并且OUT數最多(1 862個)。6份樣品中真菌的Chao1指數在47.00～2 510.14之間，ACE指數在47.42～267.25之間；樣品M1-F的Chao1指數和ACE指數最高，分別為251.14和267.25，并且OUT數最多(410個)。

細菌樣品中OUT、Chao1、ACE、Shannon指數的平均值分別為1 169、552.24、573.18、5.06；真菌樣品中OUT、Chao1、ACE、Shannon指數的平均值分別為302、164.11、170.11、1.42。細菌的數值均高于真菌，表明細菌的Alpha多樣性指數高于真菌。

稀疏曲線是評定每個樣品在當前的測序深度下是否能反映該樣品中所包含的微生物群落多樣性的標準[24-26]。6份臘肉樣品中細菌和真菌的香農指數稀疏曲線如圖1所示。由圖1可以看出，6份臘肉樣品的香農指數隨著測序量的增大呈現上升趨勢，說明在此測序水平下，樣品中還有較多的物種沒有被檢測到；當測序量較高時，香濃曲線逐漸與X軸接近平行，說明在此測序水平下，樣品中細菌和真菌的群落多樣性已得到充分的展現。

a-細菌；b-真菌圖1 細菌香濃指數稀疏曲線和真菌香濃指數稀疏曲線Fig.1 Sparse analysis diagram of bacterial index andsparse analysis of fungi Shannon index

2.2 四川傳統臘肉樣品中微生物群落在門水平的比較

表2為6份臘肉樣品從門分類水平進行鑒定的結果。由表2可知，在臘肉樣品中檢測出5個細菌門，分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，所有樣品中細菌的第一優勢門均為厚壁菌門(相對豐度大于1%)，其豐度值在84.00%～99.86%之間，平均相對豐度為95.99%；變形菌門為樣品M1、M2、M5、M6的第二優勢門；放線菌門、藍藻門和擬桿菌門平均豐度值均小于1%，為樣品中的非優勢門。厚壁菌門和變形菌門也是風干肉制品[27]、湖北省恩施臘肉[28]、傳統自然發酵酸肉[29]、4 ℃貯藏的冰鮮鴿肉[30]、發酵鰩魚[31]的優勢門，這與本研究結果一致。

表2 各樣品門水平菌群分布相對豐度Table 2 The relative abundance of microbial floradistribution at phylum level in each sample

在6份臘肉樣品中檢測出4個真菌門，分別是為子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)；其中子囊菌門為共有優勢門(相對豐度大于1%)，平均相對豐度為98.99%；擔子菌門為樣品M5的第二優勢門，球囊菌門和羅茲菌門在樣品中的豐度都很低，為非優勢門。有研究報道，子囊菌門也是發酵酸魚[32]、傳統發酵乳制品[33]的優勢門，這與本研究結果一致。

2.3 四川傳統臘肉樣品的微生物群落在屬水平的比較

表3為臘肉樣品中細菌屬水平的分類鑒定結果。由表3可以看出，葡萄球菌屬(Staphylococcus)豐度值在 63.30%～98.42%的范圍內，平均豐度為88.43%，是所有樣品中的第一優勢屬；巨球菌屬(Macrococcus)為M1、M2、M5臘肉樣品中的第二優勢屬；不動桿菌屬(Acinetobacter)是M6樣品的第二優勢屬，也是M2樣品的第三優勢屬；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、環絲菌屬(Brochothrix)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和腸桿菌屬(Enterobacter)平均豐度值在0.1%～0.2%之間，為樣品中的非優勢屬；另外，樣品中還包含許多在屬水平上未鑒定的屬(Unclassified)，其豐度值在 0.34%～9.03%的范圍內。在本研究中葡萄球菌屬為四川傳統臘肉的絕對優勢屬，秦丹[34]以四川臘肉和香腸為研究對象，得出葡萄球菌是兩者的共同優勢菌；陳美春等[1]、全拓等[6]運用純培養法對四川臘肉的細菌多樣性進行解析，發現葡萄球菌是臘肉的優勢菌；而LEE等[35]在發酵魚醬的研究中也發現葡萄球菌是其優勢菌，與本研究結果相同。陳美春等[1]和全拓等[6]的研究還表明乳酸菌是四川臘肉的優勢菌，而在本研究中檢測出的乳球菌屬和乳桿菌屬豐度較低，這可能與臘肉樣品的來源有關；與上述研究不同，本研究中發現巨球菌屬在樣品M1、M2、M5中的相對豐度大于1%，為優勢屬。

表3 各樣品屬水平細菌的相對豐度Table 3 The relative abundance of bacterial flora atgenus level in each sample

續表3

屬分類細菌屬水平相對豐度/%M1M2M3M4M5M6Exiguobacterium 0.000.010.000.000.000.00Enhydrobacter 0.000.010.000.000.010.00Kurthia 0.000.040.000.000.010.00Ewingella 0.000.010.000.000.000.00Leuconostoc 0.000.000.000.000.010.00Amycolatopsis 0.000.010.000.000.000.00Pediococcus 0.030.000.000.000.020.01Trichococcus 0.000.000.000.000.010.00Corynebacterium 0.000.010.000.000.000.00Granulicatella 0.000.010.000.000.000.00Delftia 0.000.010.000.000.000.00Aeromicrobium 0.000.010.000.000.000.00Dermacoccus 0.000.010.000.000.000.00Luteococcus 0.000.010.000.000.000.00Agrobacterium 0.000.010.000.000.000.00Agrococcus 0.000.010.000.000.000.00Patulibacter 0.000.010.000.000.000.00Lysobacter 0.000.010.000.000.000.00Novosphingobium 0.000.010.000.000.000.00Moraxella 0.000.010.000.000.000.00Geodermatophilus 0.000.010.000.000.000.00未定義6.722.881.329.034.090.34

葡萄球菌可以抑制脂肪氧化，能分解肉制品中乳酸代謝產生的過氧化物，有利于形成風味，改善色澤延緩酸敗以及提升產品質安全性[36-37]。因此四川傳統臘肉中葡萄球菌的含量可能是顏色和風味形成的主要因素[12]。

表4為臘肉樣品中真菌屬水平的分類鑒定結果。由表4可以看出，曲霉屬 (Aspergillus)豐度值在77.72%～98.42%之間，平均豐度值為88.46%，為臘肉樣品的第一優勢屬；德巴利酵母屬(Debaryomyces)為樣品M1、M3、M4、M5、M6的第二優勢屬；假絲酵母屬(Candida)為樣品M5的第三優勢屬，但假絲酵母屬在所有樣品中的平均豐度較低；節菌屬(Wallemia)、青霉菌屬(Penicillium)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)和亞隔孢殼屬(Didymella)平均豐度值在0.1%～0.5%之間，為樣品的非優勢屬；另外，樣品中還包含許多未鑒定的屬(Unclassified)，但豐度較低，其豐度值在 0.04%～1.90%的范圍內。本研究中發現曲霉屬是四川傳統臘肉的優勢屬，謝康莊等[38]采用純培養法發現曲霉菌是湘西臘肉中的優勢菌，與本文研究結果相一致。

霉菌和酵母菌為臘肉中的優勢菌可能是因為家庭自制過程中的缺陷和貯藏過程中粗放的環境有關，另外與臘肉的水分含量和濕潤氣候也有關系，導致霉菌大量增長[10]。霉菌和酵母菌在臘肉形成獨特的風味和提升安全性方面發揮了重要作用。霉菌屬于好氧菌，往往存在于臘肉表面，能夠抑制有害菌生長并且使臘肉具有特殊的香氣，添加適量霉菌，還能夠延長肉制品的保質期，有利于產品的儲存。酵母菌屬于兼性菌，在發酵時可吸收掉殘存氧氣從而能夠抑制臘肉氧化酸敗，還能阻止有害微生物的滋生，另外對臘肉風味的形成有促進作用[39-41]。

表4 各樣品屬水平真菌的相對豐度Table 4 The relative abundance of fungi flora at genuslevel in each sample

續表4

2.4 四川傳統臘肉樣品中微生物的主成分分析

在圖2中，樣品間距遠近表示了其差異性大小，2點之間的距離越近，表明2個樣本之間的微生物群落結構相似度越高，差異越小。由圖2-a可知，樣品M1與其他樣品差異較大，PC2很好地將M1和其他樣品區分開來；由圖2-b可知，樣品M2、M4與其他樣品差異較大，PC2 可以將其與其他樣品完全區分開。傳統臘肉的加工原料、加工工藝、加工環境都會直接或者間接地影響臘肉中的微生物，使得最終產品中的微生物有一定差異[6]。

a-細菌；b-真菌圖2 細菌主成分分析圖和真菌主成分分析圖Fig.2 principal component analysis for bacteria andprincipal component analysis for fungi

3 結論

本研究基于Illumina MiSeq高通量測序平臺分析了四川傳統臘肉樣品中微生物群落結構及多樣性。結果表明不同臘肉樣品中的微生物多樣性存在差異，并且樣品中細菌的Alpha多樣性指數高于真菌；臘肉中細菌和真菌群落組成分析表明，臘肉樣品中共有優勢門為厚壁菌門(Firmicutes)和子囊菌門(Ascomycota)；樣品中的共有優勢屬為葡萄球菌屬(Staphylococcus)和曲霉屬(Aspergillus)；PCA分析表明，不同來源的樣品間微生物組成有一定差異。