以廢棄畢赤酵母為高效氮源強(qiáng)化丁酸發(fā)酵生產(chǎn)

陳程，程文君，宮立鵬，丁健，史仲平*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

每年來源于化石原料的工業(yè)化學(xué)品多達(dá)8 000萬t，產(chǎn)值在2萬億美元以上?；喜豢稍偕?，石化工業(yè)存在包括溫室效應(yīng)在內(nèi)的環(huán)境污染。近年來，對利用微生物、以可再生生物質(zhì)為原料生產(chǎn)化工平臺化合物的研究越來越受到重視[1]。丁酸(butyric acid)是一種平臺化合物，廣泛應(yīng)用于食品、化工、制藥等行業(yè)，每年全球市場需求量約80 000 t。目前丁酸生產(chǎn)主要有2種方式：化學(xué)合成法與微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法產(chǎn)量高、產(chǎn)品專一性好，但生產(chǎn)操作在高溫高壓條件下進(jìn)行、且使用不可再生的化石原料。

相對于化學(xué)合成法，發(fā)酵法在緩解全球氣候變暖和溫室效應(yīng)，使用可再生資源等方面具有巨大的優(yōu)勢。目前能夠生產(chǎn)丁酸的微生物有梭菌屬(Clostridium)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、丁酸桿菌屬(Butyribacterium)細(xì)菌等[2]。丁酸發(fā)酵的主要原料包括傳統(tǒng)復(fù)合培養(yǎng)基、淀粉類物質(zhì)、糖蜜以及各種廢棄生物質(zhì)(農(nóng)業(yè)廢棄物、廚余垃圾等)，原料中的還原糖(葡萄糖)是最常見的碳源[3]。以復(fù)合培養(yǎng)基為發(fā)酵原料、葡萄糖為碳源時，需輔以使用蛋白胨和酵母粉(各5 g/L)為有機(jī)氮源，并需添加少量無機(jī)鹽，原料成本高、配料工序復(fù)雜。為降低原料成本，STEIN等利用秸稈、廚余垃圾等進(jìn)行丁酸發(fā)酵[4]。但該過程也存在一些弊端：生物質(zhì)密度低、前處理工藝繁瑣復(fù)雜、產(chǎn)物濃度低。與丁醇發(fā)酵一樣，丁酸發(fā)酵中的主產(chǎn)物丁酸對酪丁酸梭菌生長也有產(chǎn)物抑制作用，但抑制作用較弱，抑制濃度遠(yuǎn)高于丁醇發(fā)酵中的主產(chǎn)物丁醇對丙酮丁醇梭菌的抑制水平(約12 g/L)[5]。為維持細(xì)胞活性和解除產(chǎn)物抑制，JIANG等[6]以葡萄糖為原料，利用FBB(fibrous bed bioreactor)反應(yīng)器，將發(fā)酵液連續(xù)泵入纖維素床單元維持丁酸梭菌的活性，丁酸質(zhì)量濃度和生產(chǎn)效率分別可以達(dá)到86 g/L和1.1 g/(L·h)的高水平。但是，F(xiàn)BB反應(yīng)器操作復(fù)雜、成本高，很難在工業(yè)生產(chǎn)上得到應(yīng)用。

本研究室在前期研究中，以ClostridiumtyrobutyricumATCC 25755為實驗菌株，使用葡萄糖復(fù)合培養(yǎng)基為原料，發(fā)酵生產(chǎn)丁酸，發(fā)酵60 h，丁酸質(zhì)量濃度和生產(chǎn)效率分別達(dá)到27 g/L和0.45 g/(L·h)的水平[7]。以廢棄生物質(zhì)(木質(zhì)素、廚余垃圾等)為原料，如果不使用FBB反應(yīng)器和蛋白胨等高效有機(jī)氮源、丁酸濃度只能達(dá)到10～20 g/L的較低水平[3]。重組畢赤酵母(Pichiapastoris)是生產(chǎn)有用異源蛋白的重要宿主。異源蛋白主要分泌于發(fā)酵上清液，發(fā)酵結(jié)束后得到的高密度畢赤酵母是一種具有高能量密度化特征的廢棄生物質(zhì)。據(jù)研究報道，廢棄畢赤酵母含有46%的蛋白質(zhì)(氮源)和36%的多糖(碳源)[8]。為充分利用該廢棄生物質(zhì)，本研究室建立了以玉米粉/廢棄畢赤酵母為混合原料高效發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的操作策略和工藝。使用該策略，總糖的利用效率提高了80%、廢棄酵母中的碳水化合物得到了有效轉(zhuǎn)化[9]。本研究借鑒上述發(fā)酵策略，以廢棄酵母為高效氮源強(qiáng)化丁酸發(fā)酵生產(chǎn)，探索廢棄酵母的氮/碳源在丁酸發(fā)酵過程中的利用規(guī)律，旨在提高丁酸濃度、得率和生產(chǎn)效率，降低發(fā)酵原料成本，促進(jìn)半固態(tài)廢棄酵母的有效利用。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricumATCC 25755)，為可利用葡萄糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的微生物菌株。購自廣東省微生物菌種保藏中心，保藏號為GIM1.262，菌株保藏于甘油管中(-20 ℃)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BIOTECH—7JG 7 L厭氧發(fā)酵罐(配有pH電極)、BIOTECH-2020 pH轉(zhuǎn)換顯示器，上海保興生物設(shè)備工程有限公司(發(fā)酵罐配置有蛇形盤管，熱水可在蛇管中循環(huán)，控制發(fā)酵溫度)；SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；GC126氣相色譜儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；1525EF高效液相色譜儀，美國Waters公司；1100高效液相色譜儀,美國Agilent公司；MP-10C制冷/加熱循環(huán)槽，上海一恒公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州華普達(dá)公司；SHZ-D-(III)真空泵，河南鞏義予華公司。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)胞活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母抽提物5.0，胰蛋白胨5.0，K2HPO41.5，C3H7NO2S·HCl·H2O 0.3，NaCl 6.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，MgSO4·7H2O 0.6，(NH4)2SO43.0，pH自然。

發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60.0，酵母抽提物5.0，胰蛋白胨5.0，K2HPO41.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，CaCO32.0，NaCl 6.0，(NH4)2SO43.0，MgSO4·7H2O 0.6，pH 6.0。

基礎(chǔ)玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基：將玉米粉(市售)與蒸餾水一起配料，玉米粉含量為80 g/L，pH自然?；靹蚝?，先置于約95 ℃沸水中糊化處理，加入α-淀粉酶(諾維信公司，40 000 U/g)，加酶量為8.0 U/g(玉米粉)、液化處理45 min；液化后，將培養(yǎng)基置于水浴鍋中、加入糖化酶(諾維信公司，100 000 U/g)，加酶量為120.0 U/g玉米粉，62 ℃下糖化1 h，初始葡萄糖濃度為35～50 g/L。培養(yǎng)基置滅菌鍋中121 ℃下滅菌20 min。

1.4 廢棄畢赤酵母的預(yù)處理

使用產(chǎn)豬α-干擾素的畢赤酵母。廢酵母離心后，室溫收藏。固態(tài)廢棄酵母規(guī)格：含水量約65%(細(xì)胞干重約35%)。稱取適量廢棄酵母于燒杯中，加入適量NaOH固體顆粒，再加水形成250～400 g/L的廢棄酵母懸濁液(處理液)。將靜置2～3 d的懸濁液置沸水浴中蒸煮100 min，冷卻后，用98%濃H2SO4調(diào)pH至5.5～6.5。最后，按需向發(fā)酵液中添加上述懸濁液。

1.5 培養(yǎng)/發(fā)酵方法

酪丁酸梭菌活化培養(yǎng)：從甘油管中轉(zhuǎn)接一定量的酪丁酸梭菌孢子懸浮液于活化培養(yǎng)基中，用真空泵抽真空1～2 min，除去厭氧瓶和培養(yǎng)基中的氧氣，再置于37 ℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)48 h，得到種子液。

100 mL厭氧瓶發(fā)酵：按10%的接種量將酪丁酸梭菌種子液轉(zhuǎn)接于基礎(chǔ)玉米粉培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫水浴鍋培養(yǎng)。產(chǎn)氣開始后，每隔6～8 h將氣體排出，用排水集氣法計量產(chǎn)氣量。發(fā)酵約20 h，按1∶4的體積比添入所需的廢棄酵母處理液或無葡萄糖復(fù)合培養(yǎng)基(總裝液量50 mL)。產(chǎn)氣明顯減弱后結(jié)束發(fā)酵。

7 L厭氧發(fā)酵罐中靜態(tài)發(fā)酵：用制冷/加熱循環(huán)槽控制發(fā)酵溫度在37 ℃。初始pH 6.5，裝液量為2.7 L、加入10%種子液后，實際發(fā)酵液體積約3.0 L。

發(fā)酵前先通入無菌氮氣30 min，去除氧氣。接種后再次通入無菌氮氣約10 min。使用壓力調(diào)節(jié)閥將罐壓維持在0.03～0.04 MPa。發(fā)酵過程中會自產(chǎn)氣體，氣泡不斷從發(fā)酵液向頂空釋放。自產(chǎn)氣體可以保證發(fā)酵液相基本混合均勻，消耗分解后的玉米粉和固型廢棄物顆粒逐步聚集到發(fā)酵液頂層。產(chǎn)酸/產(chǎn)氣開始后，用氨水將pH手動控制在5.5～6.5。使用排水集氣法計量總產(chǎn)氣量、H2和CO2含量[10]。發(fā)酵約20 h，按1∶4的體積比添入不同規(guī)格的廢棄酵母處理液或無糖復(fù)合培養(yǎng)基。在調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH、添加廢棄酵母處理液或無糖復(fù)合培養(yǎng)基、流加葡萄糖以及取樣時，低速攪拌2～3 min(約70 r/min)。當(dāng)發(fā)酵液pH不變且產(chǎn)氣速度明顯降低后，終止發(fā)酵。

1.6 分析方法

丁酸/乙酸：氣相色譜儀測定。以異丁醇為內(nèi)標(biāo)，每個樣品測定3次取平均值。色譜條件見參考文獻(xiàn)[10]。

總糖：鹽酸水解法[11]，每個樣品測定3次，取平均值。

葡萄糖/乳酸：生物傳感分析儀測定。

二糖/三糖/三糖以上寡糖和氨基酸測定：分別使用Waters和Agilent公司的HPLC測量，色譜條件見文獻(xiàn)[9]和[12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于厭氧瓶丁酸發(fā)酵的培養(yǎng)基優(yōu)化

如表1所示，從使用50 g/L的基礎(chǔ)玉米粉培養(yǎng)基開始，通過加大玉米粉用量、適時以1∶4的比例添加無糖復(fù)合培養(yǎng)基和不同規(guī)格的廢棄酵母處理液，丁酸質(zhì)量濃度從1.16 g/L逐漸增加到9.70 g/L。

表1 不同發(fā)酵策略下丁酸發(fā)酵性能比較(100 mL厭氧瓶)Table 1 Comparison of butyrate fermentation performance under different operating conditions

注：1)廢酵母處理液為250 g/L規(guī)格，按1∶4的比例添加到發(fā)酵液后質(zhì)量濃度為50 g/L；2)廢酵母處理液為400 g/L規(guī)格，發(fā)酵液中實際質(zhì)量濃度為80 g/L

2.2 7 L厭氧發(fā)酵罐上的丁酸發(fā)酵

以80 g/L玉米粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行了7個批次實驗。結(jié)果及發(fā)酵性能歸納于圖1和表2中。

a-50 g/L玉米粉對照；b-80 g/L玉米粉+廢棄酵母處理液(250 g/L規(guī)格);c-80 g/L玉米粉+葡萄糖濃縮液流加；d-80 g/L玉米粉+無糖復(fù)合培養(yǎng)基+葡萄糖濃縮液流加；e-80 g/L玉米粉+廢棄酵母處理液+葡萄糖濃縮液流加；f-80 g/L玉米粉+廢棄酵母處理液(400 g/L規(guī)格)+葡萄糖濃縮液流加圖1 不同發(fā)酵策略下丁酸發(fā)酵性能比較(7 L發(fā)酵罐)Fig.1 Butyrate fermentation performance under different operating conditions in 7 L anaerobic fermentor

2.2.1 分批發(fā)酵

即便上罐條件下pH得到了控制，使用50 g/L玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(批次#a)，大量還原糖未被消耗利用(約10 g/L)，發(fā)酵34 h、丁酸質(zhì)量濃度僅為2.7 g/L。使用80 g/L玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基時，發(fā)酵20 h，以1∶4的比例添加廢棄酵母處理液(250 g/L規(guī)格，批次#b)。添加處理液后，產(chǎn)氣有所增加，還原糖被迅速消耗。30 h時，還原糖消耗殆盡，產(chǎn)氣和丁酸合成戛然停止，34 h時的丁酸質(zhì)量濃度僅為6.55 g/L。相關(guān)研究顯示[13]，酪丁酸梭菌難以直接利用大多數(shù)寡糖(蔗糖等)，這與上述結(jié)果是吻合的。

2.2.2 葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵批次#c，先使用80 g/L玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵。當(dāng)還原糖濃度降低到接近于0 g/L時，向發(fā)酵液中流加600 g/L的葡萄糖濃縮液，將還原糖質(zhì)量濃度提升到10～15 g/L以上。補(bǔ)糖2次，產(chǎn)氣速度逐漸下降，到約40 h產(chǎn)氣完全終止。最終的丁酸質(zhì)量濃度依舊停留在7.44 g/L的低水平上。

表2 不同操作條件下丁酸發(fā)酵性能綜合比較(7 L發(fā)酵罐)Table 2 Butyrate fermentation performance under different operating conditions in 7 L anaerobic fermentor

注：1)B/TA，丁酸濃度/總有機(jī)酸濃度；2)碳氮比(C/N)下標(biāo)“0”、“1”、“2”分別代表“發(fā)酵初始”、“添加有機(jī)氮源后”、“發(fā)酵結(jié)束”；3)廢棄酵母處理液為250 g/L規(guī)格，發(fā)酵液中的實際質(zhì)量濃度50 g/L；4)廢棄酵母處理液為400 g/L規(guī)格，實際質(zhì)量濃度80 g/L；N/A：沒有測量或沒有相應(yīng)數(shù)據(jù)

2.2.3 添加無糖復(fù)合培養(yǎng)基的葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵

發(fā)酵批次#d，先使用80 g/L玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵。發(fā)酵20 h，以1∶4的體積比添加不含葡萄糖的發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基，使所有成分(包括蛋白胨和酵母膏)達(dá)到“材料與方法”中的規(guī)定水平。與此同時，當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度降低到約10 g/L時，向發(fā)酵液中流加葡萄糖濃縮液，將還原糖質(zhì)量濃度提升到約20 g/L。在此條件下，產(chǎn)氣持續(xù)上升，66 h時丁酸質(zhì)量濃度為33.47 g/L，丁酸得率和生產(chǎn)效率分別達(dá)到0.32 g/g和0.51 g/(L·h)。

2.2.4 添加廢棄畢赤酵母處理液的葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵

前期研究結(jié)果顯示，廢棄酵母處理液中沒有葡萄糖[9]。發(fā)酵批次#e和#e2先使用80 g/L玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵約20 h，以1∶4的比例添加廢棄酵母處理液(250 g/L規(guī)格，發(fā)酵液中的廢棄酵母實際濃度50 g/L)。與此同時，當(dāng)還原糖質(zhì)量濃度降低到約10 g/L時，向發(fā)酵液流加葡萄糖濃縮液進(jìn)行補(bǔ)料，將還原糖質(zhì)量濃度提升到約20 g/L。此時，產(chǎn)氣顯著上升，發(fā)酵70 h時的丁酸質(zhì)量濃度、得率和生產(chǎn)效率分別達(dá)到44.84～45.29 g/L、0.39～0.41 g/g和0.65～0.74 g/(L·h)的高水平，比使用葡萄糖復(fù)合培養(yǎng)基為原料時分別提高61%、5%和57%[7]。由于酪丁酸梭菌只能快速、有效地利用還原糖(葡萄糖)來合成丁酸，發(fā)酵批次#f中，通過加大糖化酶用量和糖化時間，將玉米粉中的總糖全部轉(zhuǎn)化成葡萄糖，提高玉米粉的有效利用率。與此同時，進(jìn)一步加大廢棄酵母的投料量，發(fā)酵24 h時，按1∶4的比例添加400 g/L規(guī)格的廢棄酵母處理液(發(fā)酵液中的廢棄酵母實際質(zhì)量濃度80 g/L)，其余操作方式與批次#e完全相同。發(fā)酵56 h時的丁酸質(zhì)量濃度、丁酸得率、生產(chǎn)效率分別為37.44 g/L、0.43 g/g和0.67 g/(L·h)。

2.3 以廢棄酵母處理液為高效氮源并連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖濃縮液改善丁酸發(fā)酵性能

2.3.1 添加廢棄酵母處理液提高發(fā)酵體系的丁酸質(zhì)量濃度、得率和丁酸占總有機(jī)酸的比率

酪丁酸梭菌主要利用還原糖(葡萄糖)合成丁酸(乙酸和乳酸是副產(chǎn)物)。將丁酸得率和丁酸占總有機(jī)酸的比率(B/TA)分別按公式(1)(2)計算：

(1)

(2)

式中：YB、CB、CGt0、CGtf、CF、CA和CL分別代表丁酸得率、丁酸質(zhì)量濃度(g/L)、初始葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)、發(fā)酵結(jié)束時的葡萄糖質(zhì)量濃度(g/L)、單位體積發(fā)酵液的葡萄糖流加量(g/L)、乙酸和乳酸質(zhì)量濃度(g/L)。

如表2所示，相比于發(fā)酵批次#a～c，80 g/L玉米粉+無糖復(fù)合培養(yǎng)基添加+葡萄糖濃縮液連續(xù)流加的發(fā)酵體系(批次#d)中的CB和YB有明顯提高(CB=33.47 g/L，YB=0.32)。使用80 g/L玉米粉+廢棄酵母處理液(250 g/L規(guī)格，50 g/L)添加+葡萄糖濃縮液連續(xù)流加的發(fā)酵體系(批次#e和#e2)，CB和YB進(jìn)一步提高(CB為44.84～45.29 g/L，YB為0.39～0.41)。批次#f將廢棄酵母投料量提升至80 g/L(廢棄酵母處理液400 g/L規(guī)格)，CB有所降低(37.44 g/L)，但YB繼續(xù)上升(0.43)。80 g/L玉米粉+50 g/L廢棄酵母處理液+葡萄糖濃縮液連續(xù)流加的發(fā)酵體系(批次#e和#e2)的性能較為優(yōu)越，因為雖然YB略有下降，但CB提升幅度比較明顯，與添加成本較高的發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基相比，CB和YB分別提高了約36%和25%。B/TA也是衡量發(fā)酵性能的重要指標(biāo)之一，B/TA越大、丁酸含量越高，越有利于緩解下游產(chǎn)品精制過程中的分離負(fù)擔(dān)。加入無糖復(fù)合培養(yǎng)基和廢棄酵母處理液后，B/TA均可從0.62～0.75增加到0.90以上(表2)。

2.3.2 氨基酸的有效利用與發(fā)酵體系C/N的控制

添加廢棄酵母處理液(氮源)以后，有益于丁醇合成及丙酮丁醇梭菌生存的氨基酸濃度大幅提升[9]。為此，分析測量了添加酵母處理液和無糖復(fù)合培養(yǎng)基前后，以及發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中的氨基酸變化情況。一共檢測到17種氨基酸，包括谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸。有研究報道指出，谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸是有益于酪丁酸梭菌生長的氨基酸[14]。圖2的結(jié)果表明，添入2種不同的有機(jī)氮源后、總氨基酸質(zhì)量濃度從0.1～0.2 g/L大幅提高至3.69 g/L(發(fā)酵批次#d)和4.32 g/L(發(fā)酵批次#e)。谷氨酸族氨基酸(谷氨酸、脯氨酸)和天冬氨酸族氨基酸(天冬氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸)濃度也有大幅提升。發(fā)酵結(jié)束時，總氨基酸、谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸的消耗量大約為2.5、0.4和0.90 g/L。上述結(jié)果表明，加入無糖復(fù)合培養(yǎng)基或酵母處理液后，不僅形成了高氨基酸的濃度環(huán)境，同時氨基酸還得到了有效利用，這與丁醇發(fā)酵體系(玉米粉培養(yǎng)基/廢棄酵母處理液混合底物)有很大不同。后者添入酵母處理液后，只是形成了對丙酮丁醇梭菌生存/丁醇合成有益的高氨基酸濃度環(huán)境，但氨基酸本身并沒有得到實質(zhì)性的利用[9]。這樣，在丁酸發(fā)酵中，廢棄酵母處理液可以提供比無糖復(fù)合培養(yǎng)基更多的氨基酸，氨基酸利用效率基本相同，這大大降低了發(fā)酵原料成本，并實現(xiàn)了生物廢棄物的有效利用。

a-批次#d 80 g/L玉米粉+無糖復(fù)合培養(yǎng)基+連續(xù)流加葡萄糖濃縮液；b-批次#e 80 g/L玉米粉+酵母處理液+連續(xù)流加葡萄糖濃縮液圖2 7 L厭氧罐下、丁酸發(fā)酵過程中的天冬氨酸族氨基酸、谷氨酸族氨基酸和總氨基酸的變化情況Fig.2 Concentrations variations of aspartic acid family,glutamic acid family and total amino acids in 7 L fermentor

丁酸是有機(jī)酸，其結(jié)構(gòu)中沒有氮成分，氨基酸消耗不可能直接用在丁酸合成上。利用發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基生產(chǎn)丁酸時，酪丁酸梭菌在發(fā)酵24 h后基本停止生長，但產(chǎn)酸產(chǎn)氣并未停止[7]。因此，丁酸發(fā)酵屬于典型的生長半耦聯(lián)型發(fā)酵[公式(3)]，遵從Luedeking-Piret公式)，這也與LIU等[15]的研究結(jié)果相吻合。另外，使用純葡萄糖培養(yǎng)基、必須外添3%的酪蛋白水解液(總氨基酸質(zhì)量濃度約13 g/L)才能維持酪丁酸梭菌的生長和產(chǎn)酸[14]。

ρ=αμ+β，γB=ρX=ρ(αμ+β)X

(3)

式中：rB、ρ、X、μ、α和β分別代表丁酸合成速度[g/(L·h)]、丁酸比合成速度(h-1)、細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L)、細(xì)胞比生長速度(h-1)、(生長)耦聯(lián)系數(shù)和非耦聯(lián)系數(shù)。酪丁酸梭菌生產(chǎn)丁酸屬于典型的厭氧發(fā)酵，發(fā)酵液中的各類氨基酸是構(gòu)成細(xì)胞的重要骨架物質(zhì)。氨基酸依靠糖酵解途徑中所生成的ATP的能量支撐，參與到細(xì)胞同化途徑中、合成細(xì)胞，并最終得到消耗利用(圖3)。

圖3 本發(fā)酵策略下的酪丁酸梭菌合成丁酸的代謝圖Fig.3 C. tyrobutyricum ATCC 25755 metabolismmap under the proposed fermentation strategy

如公式(3)所示，在還原糖存在的條件下，細(xì)胞生長速度或濃度越大，丁酸合成速度越高。因此，氨基酸的消耗利用，提高了細(xì)胞生長速度和濃度，間接促進(jìn)了丁酸合成。另外，C/N也是影響發(fā)酵性能的一個關(guān)鍵因素。表2概括總結(jié)了發(fā)酵初始、添入有機(jī)氮源后和發(fā)酵結(jié)束時的C/N。由于只有還原糖和氨基酸可以被酪丁酸梭菌快速有效利用，故將發(fā)酵體系的C/N定義為：發(fā)酵液中葡萄糖濃度CG(t)與總游離氨基酸濃度CTAA(t)之比。

(4)

前期實驗結(jié)果表明[9]，80 g/L玉米粉培養(yǎng)基中氨基酸含量很低，僅有約0.3 g/L。表2的結(jié)果顯示，所有批次的初始C/N在110～180之間。添加有機(jī)氮源后、批次#d-f的C/N下降到5.0～6.2，發(fā)酵結(jié)束時的C/N維持在4.1～16.4(批次#d-f)。一般而言，高C/N有利于有機(jī)代謝產(chǎn)物的合成，而低C/N則有利于細(xì)胞生長。添入有機(jī)氮源(無糖復(fù)合培養(yǎng)基和廢棄酵母處理液)后，C/N迅速下降到5.0～6.3，連續(xù)流加葡萄糖濃縮液后，細(xì)胞還可以繼續(xù)生長直到較高濃度，使得最終丁酸濃度有較大幅度的提升。

2.3.4 添加廢棄酵母處理液時提高丁酸得率

廢棄酵母預(yù)處理無法將廢棄酵母中的多糖降解成單糖，只能降解成難以用于丁酸合成的二糖、三糖以及三糖以上寡糖[9]。表3中總結(jié)歸納了發(fā)酵批次#e和#f中，添入不同酵母處理液前后，以及發(fā)酵結(jié)束時的二糖和三糖濃度。

表3 添加酵母處理液前后及發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵體系中的二糖/三糖質(zhì)量濃度 單位：g/L

發(fā)酵批次#e中，由于玉米粉培養(yǎng)基沒有完全糖化，添加酵母處理液前的二糖和三糖質(zhì)量濃度高。加入酵母處理液(250 g/L)后，二糖和三糖質(zhì)量濃度分別為11.00 g/L和4.28 g/L，發(fā)酵結(jié)束時，降低到4.46 g/L和1.22 g/L。批次#f中，玉米粉培養(yǎng)基糖化程度高，添加酵母處理液前的二糖和三糖質(zhì)量濃度低。加入酵母處理液(400 g/L)后，二糖和三糖質(zhì)量濃度分別是1.27 g/L和4.54 g/L，發(fā)酵結(jié)束時，降低到1.05 g/L和0.63 g/L。因此，酪丁酸梭菌仍然具有微弱的利用二糖和三糖的能力。批次#e和批次#f中的二糖和三糖總消耗量分別為9.60 g/L和4.13 g/L，雖然比葡萄糖消耗量(批次#e，約300 g/L；批次#f，約168 g/L)少得多，但這卻意味著葡萄糖添加量有2.4%～3.2%降低的可能，丁酸得率在批次#d的基礎(chǔ)上又有新的提升(32%上升至40%)。

3 結(jié)論

本研究建立了在以玉米粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基、廢棄酵母處理液為高效氮源、同時連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖的高效丁酸發(fā)酵工藝。該工藝可以有效地利用來自于廢棄酵母處理液中的氨基酸，提高細(xì)胞生長速度和濃度，增強(qiáng)NADH的再生速度，從而間接改善丁酸發(fā)酵的性能。與使用傳統(tǒng)發(fā)酵用復(fù)合培養(yǎng)基相比較，該工藝可提高丁酸濃度，得率和生產(chǎn)效率達(dá)61%、5%和57%，價格昂貴的氮源(蛋白胨和酵母膏)可以得到完全替代，節(jié)約了發(fā)酵原料成本，提升了發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)效益，實現(xiàn)了低值固態(tài)生物質(zhì)的資源化、環(huán)境效益明顯。但是，酪丁酸梭菌只能高效利用葡萄糖，玉米粉基礎(chǔ)培養(yǎng)基和廢棄酵母處理液中的寡糖利用率低，為利用殘存寡糖，必須加大初始糖化酶用量并使用葡萄糖濃縮液進(jìn)行補(bǔ)料。丁酸是丁醇發(fā)酵的前體物質(zhì)之一，丁醇發(fā)酵中，使用丁酸為發(fā)酵原料比使用葡萄糖更為高效(但仍需來自于糖酵解途徑的NADH)。丙酮丁醇梭菌可以分泌糖化酶，利用寡糖的能力強(qiáng)，但氨基酸的利用能力低；與之相反，丁酸發(fā)酵無法有效利用寡糖，但氨基酸利用能力強(qiáng)。根據(jù)上述特征，如果把丁酸和丁醇發(fā)酵有效結(jié)合起來，即利用部分丁酸發(fā)酵液作為丁醇發(fā)酵的共同底物，有望實現(xiàn)廢棄酵母中的碳水化合物和蛋白質(zhì)的完全利用/消化，同時聯(lián)產(chǎn)丁酸和丁醇，實現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品的多樣化。最終達(dá)到利用厭氧發(fā)酵體系完全消化固態(tài)廢酵母，生產(chǎn)有用平臺化合物的目標(biāo)。