綿陽地區山羊糞便中捻轉血矛線蟲的分子鑒定

蒲善秋，簡克靈，李波，謝躍，何冉，楊光友，古小彬*

（1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川省綿陽市動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 621000）

捻轉血矛線蟲（Haemonchus contortus）主要寄生于山羊等家養和野生反芻動物的真胃，是反芻動物胃腸道寄生蟲中致病能力最強的線蟲之一，感染率高（6.5%～96%），死亡率也比較高（40%）[1]。傳統形態學方法對于形態相近的寄生蟲蟲卵和幼蟲階段的鑒定具有局限性[2]，現通常應用分子生物學方法進行蟲種鑒定[3-4]。核糖體第二內轉錄間隔區（rDNA ITS-2）基因的進化速度快，物種內高度保守，而在亞種間具有不同程度的差異[5]，已應用于圓線蟲的分類鑒定[6]。本研究采用PCR 技術對山羊糞便中疑似血矛屬線蟲蟲卵的ITS-2基因（糞便樣本來自綿陽市北川、鹽亭、三臺三個縣）進行分子鑒定和序列多態性分析，為綿陽地區山羊捻轉血矛線蟲的分子流行病學調查和種群遺傳研究提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 樣品 綿陽地區三個縣疑似有血矛屬線蟲蟲卵的山羊糞便樣品60 份，其中鹽亭縣23 份（YT1-YT23），北川縣15 份（BC1-BC15），三臺縣22份（ST1-ST22）。

1.2 試驗方法

1.2.1 蟲卵收集與保存 根據鏡檢結果，采用飽和鹽水漂浮法收集上述糞便樣品中的蟲卵，蟲卵經清水反復漂洗后，收集于1.5 mL EP管內，保存于-20 ℃待用。

1.2.2 ITS-2基因的擴增與PCR產物純化回收 將收集的蟲卵根據QIAamp?DNA Stool Mini Kit試劑盒說明書進行DNA 提取，然后將洗脫的DNA 置于-20 ℃冰箱保存備用。引物序列參考Bott等的文獻報道[7]，序列如下：P1為5′-CAAATG?GCATTTGTCTTTTAG-3′，P2為5′-TTAGTTTCTT TTCCTCCGCT-3′，引物由英濰捷基生物技術有限公司合成。

25 μL PCR 擴增反應體系為：上下游引物（20 pmol）各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。蒸餾水作為空白對照模板。PCR 擴增反應條件：94 ℃4 min；94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃30 s（共30個循環）；最后72 ℃延伸10 min。將PCR 反應產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。擴增條帶大小與預期結果相符，將目的條帶切割下來，裝入1.5 mL滅菌離心管中，根據天根公司DNA純化回收試劑盒的說明書，進行PCR產物膠回收純化。

1.2.3 克隆與測序 將上述純化的PCR 產物連接到PMD19-T 載體，將連接產物全部轉入30 μL DH5α感受態細胞中，最后將菌液涂布于含Amp的LB固體培養基，挑取單個菌落，進行菌液PCR 鑒定。取PCR 鑒定為陽性的菌液送英濰捷基生物技術有限公司測序。

1.2.4 序列分析 用MEGA5.0 軟件計算測序所得序列的各個堿基（A、T、C、G）組成的含量，將所得的測序序列根據序列是否一致進行分類，序列完全一致的歸為一種類型，否則歸為不同類型。將不同類型的ITS-2序列與GenBank中各國的捻轉血矛線蟲和柏氏血矛線蟲的ITS-2序列進行比較分析。所有序列用BioEdit 進行人工輔助校對剪切，然后通過MegAlign軟件進行序列同源性分析。采用MEGA 5.0軟件構建ML系統發育樹，同時進行1 000次的自舉檢驗（Bootstrap test）。

2 結果

2.1 PCR 擴增結果 60 份疑似血矛屬線蟲卵的糞便樣品均能特異性地擴增出約300 bp 的基因片段，與預期目的片段的長度大小相符，擴增的目的片段單一清晰（圖1）。

2.2 序列特征 測序結果顯示，60 份疑似血矛屬線蟲卵的糞便樣品均得到部分265 bp的ITS-2基因片段和部分74 bp 的28S 基因片段。經比對和編輯后，得到ITS-2基因片段長度均為191 bp，60 條序列的A、T、C、G 堿基平均含量分別為29.5%、36.2%、15.4%、18.9%，A+T 堿基含量（65.7%）顯著高于G+C 堿基含量（34.3%）。60 份ITS-2 序列共含有174 個保守位點，17 個變異位點（占8.90%，且全部為單變異位點），存在2個轉化位點，14個置換位點，1個樣品在第140位點存在堿基缺失（表1）。

圖1 山羊捻轉血矛線蟲ITS-2基因部分PCR產物

測序所得的60條序列共有15種不同的基因序列，將這15 種不同的序列命名為H1～H15。7個 樣 品（BC1、BC8、BC13、BC15、YT22、YT23、ST15）歸類為H1，25 個樣品（BC2、BC4、BC7、BC9、BC11、ST4、ST5、ST8、ST9、ST10、ST14、ST17、ST19、ST22、YT1、YT2、YT7、YT8、YT9、YT11、YT14、YT15、YT16、YT17、YT21）歸類為H2，15 個樣品（BC3、BC5、BC6、BC10、BC12、BC14、YT5、YT6、YT10、YT12、YT19、ST1、ST6、ST12、ST16）歸類為H3，2 個樣品（ST7、ST20）歸類H6，余下的H4～H5和H7～H15各類型僅包含1個樣本（表1）。

2.3 ITS-2 基因序列同源性分析 所得15 種類型的ITS-2部分序列與GenBank上相關分離株的同源性為97.4%～100%，與捻轉血矛線蟲日本分離株（AB682687）的同源性為95.8%～99.0%，與馬來西亞分離株（AY647245）的同源性為96.0%～99.5%，與意大利分離株（FN432336）、美國分離株（EU084691）、也門分離株（HQ683715）的同源性均在96.4%～99.5%，與法國分離株（AJ577465）的同源性為97.4%～99.5%，與中國內蒙古分離株（HQ844231）的同源性為97.4%～100%。對所得60 條血矛線蟲的ITS-2 序列進行分析后發現：不同蟲株間序列的差異性較低，且不同地區的蟲株有完全一致的序列，各個地區蟲株的差異性并未與所采集的地區產生相關性。

2.4 ITS-2 基因序列系統進化樹構建 以山羊毛圓線蟲（T.capricola）（GenBank序列號為JF276023）和短古柏線蟲（C.curticei）（GenBank 序列號為AJ000033）作為系統發育分析的外群，利用MEGA 5.0 軟件構建系統發育樹（NJ 樹），結果顯示：本研究得到的15種類型的ITS-2序列與各國的捻轉血矛線蟲聚類形成一個小分支，且15種類型的序列不是按地區聚類，而是交叉分布。由此可見，本研究中來自山羊糞便的血矛屬線蟲均為捻轉血矛線蟲，且ITS-2 序列的變異與蟲株的地理位置無相關性。

表1 捻轉血矛線蟲15個類型的ITS-2基因序列核苷酸變異位點

3 討論

由于核糖體第二內轉錄間隔區（rDNA ITS-2）在生物進化過程中顯示種的特征，種內具有高度保守性，而在不同種間又具有不同程度的變異，所以是較理想的種間鑒定遺傳標記[8]。目前，ITS-2 作為分子分類標記已廣泛應用于寄生蟲的檢測，如弓形蟲[9-11]、隱孢子蟲[12-13]和犬新孢子蟲[14]等。目前，有關血矛線蟲的分子鑒定主要以蟲體為材料來進行，而非蟲卵。因此，本研究對綿陽地區疑似血矛屬線蟲的蟲卵進行了分子鑒定。

研究發現，測序所得60 條序列的ITS-2 和28 S基因片段的長度均為265 bp，其中ITS-2基因片段的長度為191～192 bp，該結果與Bott 等[7]報道的結果一致；且來自綿陽3 縣的60 份樣品的ITS-2基因片段與已報道的其他地理來源的捻轉血矛線蟲株的同源性達95.8%～100%。NJ 樹揭示60條ITS-2序列歸類的15種類型與源自美國、澳大利亞、法國等地的捻轉血矛線蟲聚為一大支系，且不同地理來源的蟲株并未因地域關系而歸為不同的分支，由此推測ITS-2 序列變異與蟲株地理分布的相關性不明顯。這一結果與嚴若峰[15]等報道的剛好相反，可能是由于各研究所使用的ITS-2片段大小不同所致，本研究僅用ITS-2部分片段作分析，而嚴若峰等使用的是ITS-2 全序列作分析。

4 結論

綜上所述，綿陽地區60份山羊糞便中疑似血矛屬蟲卵的樣品均為捻轉血矛線蟲（H.contortus），且ITS-2 序列在種內保守程度高，不同地域來源的分離株變異小。本研究為綿陽地區山羊捻轉血矛線蟲的分子分類和種群遺傳分析奠定了一定的基礎。