單基因和雙基因聯(lián)合治療對(duì)小鼠B16-F10黑色素瘤生長抑制作用研究

韋世元， 唐放， 彭旭， 何學(xué)令， 尹海林*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都610065； 2. 四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 成都610041)

黑色素瘤起源于黑色素細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)，并且通常在發(fā)現(xiàn)時(shí)惡性程度較高。每年約有80%的皮膚腫瘤患者死于黑色素瘤，其5年生存期不到15%。惡性黑色素瘤對(duì)放化療不敏感，對(duì)于那些失去早期手術(shù)切除治療機(jī)會(huì)的患者，通過基因靶向治療來延長生存期和改善生活質(zhì)量是一個(gè)重要的研究方向(Bartolometal.，2017；田萍，鄭玲，2017)。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)是一種主要由免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及一些腫瘤細(xì)胞分泌的造血細(xì)胞因子，可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的增殖分化，可以作為疫苗佐劑強(qiáng)化以樹突狀細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫作用(張佳奇等，2018)。血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)可以與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增長，目前常見的主要有5種：VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(KDR/Klt-1)、VEGFR3(Flt-4)、免疫防御素神經(jīng)纖毛蛋白(NRP-1)和NRP-2，其中，F(xiàn)lt-1、Flt-4和KDR/Klt-1均是蛋白絡(luò)氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)受體，F(xiàn)lt-1和KDR/Klt-1主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，而Flt-4則主要分布在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(馬銳，夏海濱，2017)。目前利用GM-CSF和Flt-kdr3單基因治療腫瘤的研究已有多篇文章，Sallinen等(2009)在sVEGFR-1(sFlt-1)、sVEGFR-2(sFlk-1/KDR)、sVEGFR-3(sFlt-4)基因轉(zhuǎn)移及其組合在異種移植小鼠腹腔內(nèi)的抗血管生成和抗淋巴管生成作用的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，可溶性VEGFRs的抗血管生成基因治療可降低異種卵巢癌移植的腫瘤生長、腫瘤血管供應(yīng)和腹水形成；Yu等(2016)通過coton優(yōu)化的GM-CSF基因顯著提高了所有細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平，有助于產(chǎn)生對(duì)HIV-1 Gag和HPV相關(guān)癌癥的強(qiáng)大免疫應(yīng)答。但這2個(gè)基因聯(lián)合進(jìn)行基因治療的研究工作未見報(bào)道，為了進(jìn)一步探討2種基因?qū)δ[瘤治療的協(xié)同作用，本研究通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的mGM-csf和mFlt-kdr3基因藥物治療黑色素肺轉(zhuǎn)移瘤和腋下實(shí)體瘤，探討其對(duì)腫瘤生長抑制的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5～6周齡BALB/c小鼠購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2013-15]，飼養(yǎng)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2016-9]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)福利和使用相關(guān)制度。

1.1.2 細(xì)胞株鼠源黑色素瘤B16-F10細(xì)胞株(四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。采用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)在5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化傳代。

1.1.3 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Gibco，青霉素-鏈霉素雙抗購自Hy-clone；基因藥物D1：H1299+pNE-5(mFlt-kdr3)、D2：H1299+pNE-6(mGM-csf)由成都諾恩生物科技有限公司提供(批號(hào)分別為2018081302、2018081301)，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 B16-F10肺轉(zhuǎn)移模型建立收集對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好(可見明顯梭形結(jié)構(gòu)和黑色顆粒狀)的B16-F10細(xì)胞，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基1 000 r·min-1離心3 min，洗滌1次后PBS重懸，接著用0.04%臺(tái)盼藍(lán)染液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞活力(細(xì)胞活力=活細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%)，待細(xì)胞活力達(dá)到90%以上時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL。冰袋保溫將細(xì)胞送到無菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，在35只小鼠尾部近末端1/3處用尾靜脈注射法緩慢注射0.2 mL細(xì)胞懸液。

1.2.2 腋下實(shí)體瘤模型建立收集對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好(可見明顯梭形結(jié)構(gòu)和黑色顆粒狀)的B16-F10細(xì)胞，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)基1 000 r·min-1離心3 min，洗滌1次后PBS重懸，接著用0.04%臺(tái)盼藍(lán)染液染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞活力，待細(xì)胞活力達(dá)到90%以上時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。冰袋保溫將細(xì)胞送到無菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，在35只小鼠左腋下方用皮下注射法注射0.1 mL細(xì)胞懸液。

1.2.3 肺轉(zhuǎn)移模型分組及處理接種后21 d將小鼠隨機(jī)分成5組：mFlt-kdr3治療組、mGM-csf治療組、聯(lián)合治療組(1次mFlt-kdr3，2次mGM-csf)、H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，每組6只。所有小鼠均采用尾靜脈注射法注射對(duì)應(yīng)基因藥物。注射劑量為80 μL/只，隔天治療，總計(jì)3次。

1.2.4 實(shí)體瘤模型分組處理接種后7 d將小鼠隨機(jī)分成5組：mFlt-kdr3治療組、mGM-csf治療組、聯(lián)合治療組(1次mFlt-kdr3，2次mGM-csf)、H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，每組6只。所有小鼠均采用瘤體穿刺給藥法注射對(duì)應(yīng)基因藥物，注射劑量為25 μL/只，隔天治療，總計(jì)9次。

1.2.5 療效觀察肺轉(zhuǎn)移模型小鼠治療結(jié)束后3 d，即第30天時(shí)，用斷頸法處死全部小鼠，并解剖剝離小鼠肺組織，同時(shí)對(duì)各組小鼠肺部黑色素瘤轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。實(shí)體瘤模型小鼠每次注射給藥前用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤長徑(a)、短徑(b)，腫瘤平均體積=1/2ab2；相對(duì)腫瘤體積(RTV)=Vt/V0，式中，V0為給藥前腫瘤體積，Vt為各個(gè)時(shí)間段腫瘤體積；腫瘤相對(duì)生長速度=TRTV/TCTV，式中，TRTV為治療組某一時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積變化率，即腫瘤體積與給藥前腫瘤體積的比值，TCTV為生理鹽水對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積變化率；療效價(jià)值=TRTV/TCTV×100%，若療效價(jià)值≤60%時(shí)，表明該藥物治療有效。

1.2.6 蘇木精-伊紅(HE)染色肺轉(zhuǎn)移模型小鼠肺組織用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、組織切片按照常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，電鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.7 毒副作用觀察試驗(yàn)期間觀察小鼠的一般情況，包括飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量變化以及有無意外死亡等。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mGM-csf、mFlt-kdr3和雙基因聯(lián)合治療組對(duì)小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶形成的抑制作用

mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組的腫瘤數(shù)目分別為2.00個(gè)±1.29個(gè)、5.33個(gè)±1.20個(gè)和1.17個(gè)±0.98個(gè)，均與生理鹽水對(duì)照組(12.83個(gè)±6.10個(gè))之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組(10.83個(gè)±5.17個(gè))和生理鹽水對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.2 肺轉(zhuǎn)移模型病理學(xué)變化

mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠的肺部結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，可見比較完整的肺泡結(jié)構(gòu)，而H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組的肺部結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺泡間隙增厚，癌細(xì)胞排列緊密，核大深染，周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(圖2)。

2.3 mGM-csf、mFlt-kdr3和聯(lián)合治療組對(duì)小鼠黑色素實(shí)體瘤生長的抑制作用

實(shí)體瘤治療實(shí)驗(yàn)中，mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠的黑色素瘤體積在18 d時(shí)分別為388.44 mm3±168.84 mm3、66.39 mm3±22.81 mm3和96.09 mm3±33.66 mm3，均顯著小于生理鹽水對(duì)照組(944.16 mm3±463.06 mm3；P<0.05)；而H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組(915.81 mm3±437.33 mm3)與生理鹽水對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05；表1)。mGM-csf治療組小鼠在6 d之前的腫瘤相對(duì)生長速度高于生理鹽水對(duì)照組，而聯(lián)合治療組腫瘤的平均體積在觀察時(shí)間段內(nèi)一直呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。聯(lián)合治療組腫瘤相對(duì)生長速度在給藥后2 d的療效價(jià)值已經(jīng)達(dá)到60%的有效值，而mGM-csf治療組和mFlt-kdr3治療組的療效價(jià)值分別在4 d和10 d達(dá)到60%(圖3)。且在實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠的飲食、皮毛、活動(dòng)以及精神狀況未出現(xiàn)異常，也未出現(xiàn)異常死亡。

表1 各組小鼠的腫瘤平均體積
Table 1 Average tumor volume of the mice in different groups

組別平均腫瘤體積(x±SD)/mm30 d2 d4 d6 d8 d10 d16 d18 dmGM-csf治療組33.16±3.1484.19±2.83227.49±47.82247.24±45.12287.99±77.85296.45±95.64378.39±149.61388.44±168.84?mFlt-kdr3治療組31.41±6.3253.29±10.95108.25±31.20110.40±33.29111.36±34.5691.97±30.3978.88±26.2466.39±22.81?聯(lián)合治療組175.22±65.59223.65±79.62194.08±81.80128.67±56.43119.62±46.44100.40±44.51101.25±34.7296.09±33.66?H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組33.27±8.4391.88±33.21283.24±116.21403.43±150.67497.80±213.94678.88±311.61818.73±384.72915.81±437.33生理鹽水對(duì)照組21.72±5.9360.20±16.12221.63±84.97317.40±125.07421.19±173.09589.70±240.31851.83±412.22944.16±463.06

注： 與生理鹽水對(duì)照組相比，*P<0.05

Note： compared with normal saline control group，*P<0.05

圖3 各組療效價(jià)值 Fig.3 Therapeutic value of different groups

3 討論

黑色素瘤是一種高度惡性的腫瘤，具有侵襲組織、持續(xù)增殖的能力，能夠逃避宿主細(xì)胞免疫監(jiān)視和免疫檢查，其在增殖轉(zhuǎn)移過程中伴隨著大量VEGF的分泌作用，VEGF與VEGFR結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性以及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)腫瘤生長轉(zhuǎn)移。因此，通過抑制VEGF與受體結(jié)合是抑制腫瘤生長的一種重要方法。如Davidoff等(2002)通過腺聯(lián)病毒載體構(gòu)建的VEGFR-2，經(jīng)門靜脈注射后在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的高表達(dá)，在2種腎腫瘤模型中觀察到顯著的抗腫瘤效果；Zhang等(2018)構(gòu)建了一種具有VEGF和CD 47雙特異性的融合蛋白-VEGFR1D2-SIRPαD1，通過抑制VEGF誘導(dǎo)的血管生成和激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬功能，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療中發(fā)揮了較強(qiáng)的抗腫瘤作用。另一方面，GM-CSF能夠促進(jìn)機(jī)體相關(guān)抗原的呈遞、增殖和分化，增強(qiáng)胞毒細(xì)胞活性，提高機(jī)體的免疫能力(張佳奇等，2018)。Tada等(2012)在體外將未成熟的樹突狀細(xì)胞與自體腫瘤抗原及GM-CSF、IL24共培養(yǎng)后皮內(nèi)注射治療2例原發(fā)性肝癌患者，結(jié)果有1例患者出現(xiàn)腫瘤生長減慢現(xiàn)象。RaziSoofiyani等(2017)在研究GM-CSF基因治療對(duì)小鼠纖維肉瘤模型腫瘤消退的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因治療的模型小鼠的腫瘤體積極顯著縮小。

非病毒載體中的脂質(zhì)體載體具有包含量大、免疫原性小、成本效益高、易于生產(chǎn)和保護(hù)作用強(qiáng)的特點(diǎn)(Brenneretal.，1978)，而且Templeton等(1997)對(duì)脂質(zhì)體質(zhì)粒復(fù)合物表達(dá)效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體質(zhì)粒復(fù)合物經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入機(jī)體后會(huì)在肺部大量分布，因此，利用陽離子脂質(zhì)體構(gòu)建質(zhì)粒基因復(fù)合物能更加有效地將治療基因傳遞到靶細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)采用陽離子脂質(zhì)體包裹DNA的方法，構(gòu)建mGM-csf以及mFlt-kdr3脂質(zhì)體質(zhì)?；驈?fù)合物，用來治療小鼠B16-F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移以及實(shí)體瘤，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組小鼠肺部結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，而mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組小鼠肺部結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，僅見散在腫瘤灶，并且聯(lián)合治療組的腫瘤平均數(shù)目最少、治療效果最好。HE染色后在顯微鏡下可觀察到相對(duì)完整的肺泡結(jié)構(gòu)。實(shí)體瘤模型小鼠在給藥治療后，mGM-csf治療組、mFlt-kdr3治療組和聯(lián)合治療組腫瘤的相對(duì)生長速度顯著低于H1299脂質(zhì)體質(zhì)粒對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，且聯(lián)合治療組的腫瘤平均體積呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，藥物療效為：聯(lián)合治療組>mFlt-kdr3治療組>mGM-csf治療組。即聯(lián)合基因藥物療效大于單一基因藥物，可能是2種基因在靶細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)，一方面能夠抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；另一方面靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的GM-CSF能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞在腫瘤部位的浸潤，增強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤能力。

mGM-csf治療組在最開始給藥的6 d表現(xiàn)出反?，F(xiàn)象，其腫瘤平均體積增長相對(duì)速度高于生理鹽水對(duì)照組，直到第10天左右才達(dá)到60%的治療有效標(biāo)準(zhǔn)。推測原因是藥物注射后免疫作用尚未啟動(dòng)；還有可能是在免疫治療后激活免疫反應(yīng)的過程中，由于有淋巴細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致腫瘤負(fù)荷暫時(shí)性增加。因此，這種短期腫瘤負(fù)荷的增加不一定是由于腫瘤生長所致的(Hodietal.，2008)。

利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的mGM-csf以及mFlt-kdr3治療黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移以及實(shí)體瘤，結(jié)果表明：2種單一基因藥物均對(duì)肺部轉(zhuǎn)移腫瘤灶的形成以及實(shí)體瘤的生長有一定的抑制作用，并且聯(lián)合治療組抑制作用更加明顯。這為今后的腫瘤臨床治療和藥物開發(fā)提供了一個(gè)新思路，同時(shí)也為后續(xù)的協(xié)同機(jī)理探討奠定了一些基礎(chǔ)。