酒石酸美托洛爾對脂多糖致急性肺損傷小鼠的炎癥及凋亡的影響

李 霞 王 姣 河北省邢臺市人民醫院重癥醫學科 054000

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distresss syndrome,ARDS)是由多種原因引起的肺部過度炎癥反應，臨床表現為呼吸窘迫、難治性低氧血癥。其發病機制尚未完全明確，主要有以下4個學說：交感神經學說、細胞凋亡學說、內毒素學說、肺泡巨噬細胞(AM)學說[1]。交感神經學說認為交感神經興奮、腎上腺素能受體過度激活，啟動了炎癥反應的發生發展，造成多系統損害及多器官功能障礙，呼吸系統表現為ALI/ARDS。Zhang等[2]研究表明，應用α2A受體阻斷劑，抑制交感神經活性可以減輕內毒素血癥的炎癥反應。

β受體阻滯劑在心血管學科廣泛應用，通過拮抗兒茶酚胺類腎上腺素能遞質，阻斷腎素血管緊張素醛固酮系統，明顯降低冠心病、心功能不全、高血壓患者的死亡率。但β受體阻滯劑對急性肺損傷是否具有保護作用，目前國內未見研究。酒石酸美托洛爾(Metoprolol Tartrate)是一種選擇性β1受體阻斷劑，對β2受體作用較弱，無內在擬交感活性。因此本文通過復制LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型，觀察酒石酸美托洛爾對炎癥因子TNF-α及凋亡蛋白Caspase-3表達的影響，為急性肺損傷治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康雄性昆明小鼠18只，體重28～32g (由河北醫科大學動物實驗中心提供)，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS，美國sigma公司)、酒石酸美托洛爾(哈藥集團生物工程有限公司)；Caspase-3抗體(中國Affinity公司)，TNF-α ELISA試劑盒(上海欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 實驗分組 實驗小鼠隨機分為三組，每組6只，小鼠尾靜脈注射LPS 10mg/kg復制急性肺損傷小鼠模型，造模成功后2h對照組給予生理鹽水，干預組給予酒石酸美托洛爾。(1)對照組(腹腔注射生理鹽水0.1ml/20g，q12h)；(2)干預組1(腹腔注射酒石酸美托洛爾2.5mg/kg，0.1ml/20g，q12h)；(3)干預組2(腹腔注射酒石酸美托洛爾5mg/kg，0.1ml/20g，q12h)。48h后頸動脈放血處死小鼠，留取頸動脈血及肺組織標本。

1.3 血清TNF-α水平的測定 留取小鼠頸動脈血，4℃離心，取上清液-80℃保存，血清TNF-α采用ELISA法測定，嚴格按照說明書操作。

1.4 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)測定肺組織凋亡蛋白Caspase-3的表達 小鼠肺組織-80℃保存，提取肺組織總蛋白，BCA法蛋白定量，10%SDS-PAGE蛋白電泳(上樣20μg)，轉PVDF膜，封閉，加一抗(1∶500)，洗膜后加二抗(1∶1 000)，顯影，統計光密度值計算各組蛋白的表達。

1.5 統計學方法 實驗結果以均數±標準差表示，通過SPSS16.0統計學軟件進行單因素方差分析檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學觀察 造模后各組小鼠皮毛皺縮，活動及覓食行為減少，輕度氣喘，藥物干預組小鼠較對照組活動更少。

2.2 血清炎性因子TNF-α的水平 與對照組相比，酒石酸美托洛爾干預組(2.5mg/kg；5mg/kg)明顯降低了血清TNF-α水平[(485．35±24)ng/L VS(566．57±16)ng/L；(467．63±20)ng/L VS (566．57±16)ng/L]，P值均≤0.05，差異具有統計學意義。

2.3 Western-blot法檢測 Caspase-3蛋白的表達水平 如圖1所示，與對照組相比，兩種劑量的酒石酸美托洛爾干預明顯降低了凋亡蛋白Caspase-3的表達，差異有明顯的統計學意義(P≤0.05)，提示酒石酸美托洛爾干預能夠減少LPS致急性肺損傷小鼠肺組織凋亡蛋白Caspase-3的表達。

3 討論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)是患者入住重癥醫學科常見原因，近年隨著抗菌藥物、小潮氣量肺保護通氣、俯臥位、ECMO等方法使用明顯降低了病死率，但ALI/ARDS仍是危重癥患者死亡主要原因[3]。LPS又名脂多糖，是革蘭氏陰性桿菌細胞壁上的主要成分，通過激活單核—巨噬細胞，釋放多種炎癥介質和大量氧自由基等物質誘發急性肺損傷。本研究通過靜脈注射LPS建立急性肺損傷小鼠模型，從炎性因子、凋亡蛋白方面發現酒石酸美托洛爾對急性肺損傷具有保護作用，為急性肺損傷治療提供新的思路。炎癥學說是ALI/ARDS發病機制之一[4-5]，肺內源性或肺外源性因素引起的炎癥反應，大量的炎性因子釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-6，觸發炎癥瀑布效應，導致炎癥反應失控，誘導炎細胞浸潤，引起彌漫性肺泡損傷，是ALI/ARDS的主要病理生理機制。有學者研究發現β受體阻滯劑能減少嚴重感染和感染性體克患者的炎性細胞因子產生，減輕多臟器功能衰竭，從而降低住院病死率[6]。本研究通過復制LPS急性肺損傷小鼠模型，發現酒石酸美托洛爾能降低LPS致急性肺損傷小鼠血清炎性因子TNF-α的水平，提示酒石酸美托洛爾具有抗炎作用，但其具體作用部位、作用機制不明。同時研究中觀察了肺組織的HE染色，但各組中病理切片炎細胞浸潤未見明顯差別，可能原因肺組織病變不均一，切片選取部位有關。

圖1 酒石酸美托洛爾對肺組織Caspase-3表達的影響注：凋亡蛋白Caspase-3及內參GAPDH的表達，A:對照組(LPS+生理鹽水)，B：干預組1(LPS+酒石酸美托洛爾2.5mg/kg)，C：干預組2(LPS+酒石酸美托洛爾5mg/kg)，與對照組相比，酒石酸美托洛爾干預組明顯降低了Caspase-3的表達，P ≤0.05。

ALI/ARDS的凋亡學說認為炎癥反應、氧化應激導致肺組織凋亡信號過度表達，抑制凋亡因子表達相對不足，導致肺組織進行性損傷凋亡，肺泡組織結構遭到破壞，臨床出現嚴重的低氧血癥，呼吸衰竭。Caspase家族與細胞凋亡密切相關，Caspase-3是其家族中最重要的一員，是凋亡發生多條路徑的最終執行者，它的激活直接導致細胞凋亡，本研究發現酒石酸美托洛爾下調LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織caspase-3的表達，從而使肺組織細胞凋亡率下降，對LPS致急性肺損傷小鼠起到保護作用。

總之，本研究發現酒石酸美托洛爾能夠減少LPS致急性肺損傷小鼠血清炎性因子TNF-α水平及肺組織凋亡蛋白Caspase-3的表達，但其具體作用機制還不清楚，有研究表明交感神經興奮啟動了膿毒癥全身炎癥反應的發生和失控[2]，酒石酸美托洛爾是β受體阻斷劑，可能通過拮抗交感神經的作用發揮抗炎及減輕凋亡作用，進一步研究可從動物及細胞水平探討其可能的機制。