RNA IncWDR 26表達水平與肝癌患者疾病進展和預后的相關性*

陳寶勝 劉雅剛 張吉水 宋 哲

河北省滄州市中心醫院普通外二科 061000

我國是肝癌大國，每年發病率及死亡率約占全球總數的一半[1]，當前肝臟切除術仍是治療肝癌的首選方案，治療后5年生存率約為30%[2]，預后普遍較差，因此探究肝癌發生機制及新的預后指標對于肝癌患者治療及改善生存具有重要意義。有研究顯示長鏈非編碼RNA(Long chain non-coding RNA，IncRNA)在肝細胞癌中表達異常[3]，同時IncRNA也被證實是肝癌發生及進展的關鍵因素，其主要通過修改染色體結構及調控基因的表達進而發揮作用[4]，當前已識別多種IncRNA與肝癌的關系[5-6]，但仍有很多IncRNA與肝癌的關系尚未明確，其中IncRNA WD repeat domain 26(IncWDR26)，基因序列(RP11-36-5O16)，雖與其他惡性腫瘤有顯著相關性[7]，但與肝癌患者疾病進展及預后的關系尚無相關報道，為此，本研究主要探究上述關系，現匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—2017年1月在我院診斷及治療的肝癌患者，納入標準：(1)肝癌診斷明確，符合中國抗癌協會肝癌專業委員會《原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015版)》[8]；(2)手術適應證明確，符合《原發性肝癌診療規范》[9]，手術過程順利且達到根治性切除標準；(3)年齡<75歲；(4)治療依從性好，可接受長期隨訪。排除標準：(1)既往或存在其他惡性腫瘤；(2)伴有肝臟發育異常或其他疾病及治療史；(3)已喪失手術機會使用放療或化療患者。共納入142例患者，根據IncWDR26表達水平分為高水平組(71例)及低水平組(71例)。本研究已告知患者并簽署知情同意書。

1.2 IncWDR26的檢測

1.2.1 組織收集：所有患者肝癌組織及非癌組織于手術中收集并經病理切片證實，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 總RNA提取：使用總RNA提取試劑盒(購自Thermo Fisher Scientifc公司)進行提取，提取后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 qRT-PCR檢測：設計合成相應的引物，分別用來擴增IncRNA，取上述1μg總RNA，根據 PrimeScript RT reagent kit 試劑盒(購自TaKaRa公司)說明書進行反轉錄，使用Step-One Plus Detection System(美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR檢測，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參對照，定量測量使用2-ΔΔCt方式，引物如下：GAPDH-F：5’-GATTCCACCCATGHCCAAATTC-3’，GAPDH-R：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’；IncWDR26-F：5’-AGACCTGACCTGGAATGAGA-3’，IncWDR26-R：5’-TGGGCAACAGAGCAAGATT-3’；WDR26-F：5’-CATGGAAGGAGACTGGGATAAG-3’，WDR26-R：5’-GATTTCAAGTGCGCCTCTTAC-3’。

1.3 評價指標 對比兩組一般資料，包括：性別、年齡、腫瘤直徑、巴塞羅那分期(Barcelona Clinic Liver Cancer，BCLC)分期、術前甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)水平、手術方式及術后并發癥發生情況。同時比較兩組總生存期(Overall survival，OS)、無事件生存(Event free survival，EFS)情況，OS定義為：患者從開始治療至死亡或隨訪截止的時間。EFS定義為：從入組開始到發生任何肝癌進展事件的時間，進展事件包括肝癌復發、再次手術、改為化療、加用其他治療、發生致死性或不能耐受的副作用。

1.4 隨訪 兩組患者每2個月于門診進行隨訪，檢查項目包括：CT/MRI、血清AFP，對于可疑復發者進一步檢查DSA或穿刺活檢確診，并根據檢查結果選擇二次手術、射頻消融、肝動脈化學栓塞等治療，預計隨訪時間24個月，隨訪截止日期2019年1月1日。

2 結果

2.1 患者IncWDR 26表達情況 142例患者腫瘤組織中平均IncWDR 26水平為0.12±0.47(log10)，非腫瘤組織中平均IncWDR 26水平為0.21±0.51(log10)，腫瘤組織顯著低于非腫瘤組織(t=3.093，P=0.002)，以腫瘤組織IncWDR 26水平中位數0.13將所有患者分為高水平組(71例)及低水平組(71例)。

2.2 兩組患者一般資料情況 高水平組在腫瘤直徑≤5cm、BLCL分期A期人數比例顯著高于低水平組(P均<0.05)，詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較[n(%)]

注：a表示t檢驗；b表示χ2檢驗；c表示Fisher確切概率法；d表示秩和檢驗。

2.3 兩組患者進展情況 本研究中患者隨訪時間為8～24個月，中位隨訪 18個月，高水平組有3例失訪，低水平組有2例失訪。截止末次隨訪，高水平、低水平組中位EFS時間分別為23(16～24)個月、18(16～24)個月，高水平組疾病進展風險顯著低于低水平組(HR=0.645,95%CI:0.418～0.996,P=0.036)。詳見圖1。

2.4 兩組患者總生存情況 高水平組未達中位OS時間，低水平組中位OS時間為22(18～24)個月，高水平組死亡風險顯著低于低水平組(HR=0.509,95%CI:0.310～0.834,P=0.006)。詳見圖2。

3 討論

肝癌術后復發率較高，是影響患者預后的主要因素[10]，當前已明確的復發因素包括：腫瘤包膜侵犯、血管侵犯進而導致手術前患者肝內已存在微小轉移灶或殘余腫瘤[11]，但其發生的分子機制尚不明確。IncRNA是一類長度>200個核苷酸，且不具有編碼功能的RNA片段，以往認為其無明顯生物學作用[12]，但當前研究已證實多種IncRNA在惡性腫瘤的發生及進展中具有重要作用，并與肝癌及治療后病情進展具有顯著聯系，而目前IncWDR26與手術后肝癌患者疾病進展及預后的關系尚不明確。

圖1 兩組無進展生存情況

圖2 兩組總生存情況

本研究結果顯示患者腫瘤組織中IncWDR 26水平顯著低于非腫瘤組織，表明IncWDR 26在肝癌的發生過程中具有一定作用。IncRNA主要作用是調節靶基因的表達，IncWDR 26已被證實可與轉錄因子(SIX3)發生相互作用，使SIX3與WDR 26啟動序列結合，減少細胞內SIX水平并同時抑制WDR 26的轉錄，而SIX3是多種惡性腫瘤的抑制劑，其通過下調多種致癌基因(AURKA/B、S100P、TGFB3、GINS3)的表達而發揮抑癌作用[13]，因此IncWDR 26水平降低可能參與了肝癌的發生過程，Chen[14]研究也顯示IncWDR 26可通過SIX3進而抑制肝細胞癌的生長和轉移。

本研究結果還顯示，高水平組在腫瘤直徑≤5cm、BLCL分期A期人數比例顯著高于低水平組，表明高水平IncWDR 26腫瘤病情顯著優于低水平。腫瘤直徑及BLCL分期與肝癌預后有顯著聯系，腫瘤直徑越小、肝功能分期越好其預后情況也越好[15]，WDR 26屬于WD重復蛋白家族，此家族中多種蛋白均參與了細胞多項活動，包括：細胞周期進展，信號轉導，凋亡和基因調節[16]，同時研究證實WDR 26抑制絲裂原活化蛋白激酶通路[17]，并促進細胞增殖、遷移和侵襲[18]，且在肝細胞癌中IncWDR 26與WDR 26水平呈顯著負相關[14]，這可能是高水平IncWDR 26抑制腫瘤生長及轉移的機制之一。

同時本研究隨訪結果顯示，高水平組疾病進展風險與死亡風險均顯著低于低水平組，表明高水平IncWDR 26可有效提高患者預后。肝癌術后進展是影響治療效果的主要因素，同時提高生存時間對于肝癌患者具有重要意義，由于IncWDR 26可通過SIX3及調節細胞增殖進而發揮抑癌作用，因此可有效提高肝癌患者EFS及OS，并也可作為肝癌患者術后獨立預測因子，對制定治療策略起到重要作用，同時也為肝癌的治療提供了新的方向。

綜上所述，IncWDR 26表達水平與肝癌患者疾病進展及預后有顯著聯系，水平越高預后越好。