冠狀動脈粥樣硬化新生滋養(yǎng)血管節(jié)段異質(zhì)性及其對鈣化出血的作用

蔡 輝 趙施竹

河南省鶴壁煤業(yè)公司總醫(yī)院ICU科，河南省鶴壁市 458000

動脈粥樣硬化是一種進行性、血管壁炎癥病變，可開始于生命早期，表現(xiàn)為脂質(zhì)條并進展為突出病變，成年時形成成熟斑塊，常含有羥磷灰石鈣沉積[1]。粥樣硬化斑塊組織學范圍和鈣鹽沉積之間有高度相關(guān)性[2]。習慣上講，血管外壁，包括外膜層和滋養(yǎng)血管(VV)，在粥樣硬化中起被動作用。 與此相反，有報道認為外膜層在維持血管完整性方面具有重要作用，對于粥樣硬化啟動和進程及重塑過程亦有影響[3]。實驗研究表明外膜的處理，更為特別的是滋養(yǎng)血管，可導致內(nèi)層改變，類似粥樣硬化過程[4]。大動物模型使用微型計算機斷層(micro-CT)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)早期粥樣硬化與滋養(yǎng)血管新生有關(guān)[5]。 其他的機制包括VV通過介導、定位及促進脂質(zhì)進入和炎癥細胞浸潤而加快粥樣硬化進程，這些都是不穩(wěn)定斑塊的特征[6-7]。 而且，新形成滋養(yǎng)血管的脆弱性有泄漏或破裂的傾向可能介導斑塊內(nèi)出血，是動脈粥樣硬化病變發(fā)生過程中常發(fā)生的重要事件[8]，可發(fā)展為斑塊破裂，最終導致血栓形成或血管急性閉塞[9-10]。 因而，可以推測VV新生與動脈粥樣硬化啟動和進展相關(guān)，主要是通過細胞增生、游移和斑塊內(nèi)基質(zhì)生成。本研究的目的是觀察冠狀動脈節(jié)段VV新生與滋養(yǎng)血管破裂并發(fā)癥和斑塊內(nèi)出血的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 50段冠狀動脈(取自20支冠狀動脈： 左前降支10支、右冠動脈5支、回旋支5支) 取自15例患者尸體解剖。動脈段的組織學分類正常(無粥樣斑塊，n=12)、非狹窄斑塊(輕微或無腔內(nèi)斑塊損害，管腔狹窄<50%，n=18)、非鈣化狹窄 (管腔斑塊損害，管腔狹窄>50%，斑塊鈣化面積<50%，n=10)、鈣化狹窄斑塊 (>50%的管腔狹窄及>50%斑塊鈣化面積,n=10)。

1.2 Micro-CT分析

1.2.1 標本制備和成像：在尸檢過程中，對心臟進行特殊護理，以保護動脈周圍的組織，避免損傷外膜。冠狀動脈注射 MicrofilTM(Flow Tech,Inc.Carver,MA)，為進行micro-CT 掃描做準備[11]。

1.2.2 分析： 應用 Analyze?software (Biomedical Imaging Resource,Rochester,MN)進行數(shù)據(jù)分析。對每段以400μm間距切片 35～40層[12]。對每層 micro-CT 切片，根據(jù)文獻[5,11]方法確定血管壁區(qū)域(由外膜的外邊界確定)，按照文獻[13]確定滋養(yǎng)血管參數(shù)。使用連接工具，包括 Analyze?software，對動脈進行3D成像。如圖1，該工具能識別各VV血管“樹”并追蹤其起源。這樣可將內(nèi)部VV(直接起源于主腔)和外部VV(起源于主要冠狀動脈分支)加以區(qū)分[11]。隨后2D成像分析只包括那些實際灌注的VV，即與系統(tǒng)循環(huán)連接者，不包括離外膜很近但實際上不是VV的血管。

圖1 冠狀動脈斑塊和VV容積成像
注：三維微CT圖像顯示的冠狀動脈腔為紅色，非鈣化和鈣化斑塊區(qū)域由箭頭表示。

1.3 組織學檢查 石蠟包埋后，將動脈橫切面切片置于載玻片上，用H&E染色。采用平行組織切片法對微CT圖像進行外周邊界追蹤和VV識別的準確性已經(jīng)有文獻進行了驗證[11]。

1.3.1 Von Kossa 鈣染色：切片經(jīng)脫蠟、蒸餾水水化，放入6%硝酸銀孵育箱中30min；此后，切片用蒸餾水沖洗，5%硫代硫酸鈉孵育5min；切片用自來水沖洗5min，0.1%的核固紅染色3min。 用蒸餾水沖洗后， 切片在顯微鏡下觀察(圖2)。

圖2 鈣化狹窄斑塊的Micro-CT和組織學注：A:LAD切片的H&E染色標記顯微CT與組織學匹配的解剖學標志 B:與同一水平的組織學切片相應的微CT圖像，斑塊鈣化顯示黑色強度信號，腔內(nèi)光亮為 Microfil C:圖A放大后 D:圖B 切片上游micro-CT E～H:鈣化區(qū)的不同染色。

1.3.2 血型糖蛋白A染色：脫蠟組織學切片應用抗血型糖蛋白A(CD235a,1∶100;DakoCytomation)識別非鈣化和鈣化斑塊內(nèi)紅細胞碎片(圖3)。正常人類骨髓切片用于陽性對照。我們沒有在正常的冠狀動脈段中觀察到紅細胞碎片的證據(jù)，但是在動脈粥樣硬化斑塊段中有明顯的陽性染色。

圖3 不同的動脈粥樣硬化期的血型蛋白A染色 注：糖合蛋白A染色與正常(A)、非狹窄(B)和狹窄斑塊(C)的蘇木(左)對照，并進行相應的放大(右)。

1.3.3 Mallory’s 鐵染色：脫蠟與水化后，切片應用亞鐵氰化鉀/鹽酸溶液(50ml 5% 亞鐵氰化鉀,50ml 5%鹽酸)染色10min。將切片用蒸餾水沖洗，核固紅染色5min，流動水沖洗2min，放顯微鏡下觀察。

1.3.4 VEGF、TNF-α和eNOS 染色：切片厚4mm。應用抗原回收溶液進行抗原回收。然后用5%的過氧化氫將切片封堵15min。因子Ⅷ抗體(1∶50)內(nèi)持續(xù)30min。 Dako LSAB2工具包用于二級和三級步驟。使用 Dako DAB顯色劑。之后，切片置于相應抗體內(nèi)60min(eNOS, predilute;VEGF,1∶250,TNF-α,1∶50)。Dako LSAB2-AP 試劑盒用于后半部染色，接著用Permanent Red 顯色。

1.3.5 血型糖蛋白A和鐵評分：血管壁/斑塊區(qū)的血型糖蛋白A和鐵沉積用半定量進行分級(0～4)，分值越高表示百分值越高(1：<25%, 2：>25%但<50%,3：>50%但<75%,4：>75%)。

1.4 統(tǒng)計學方法 連續(xù)變量數(shù)值以平均值 ± 標準差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey-Kramer事后檢驗(Tukey-Kramer post hoc test)，并對多項比較進行校正，以確定各組間的統(tǒng)計差異。個體組間比較采用非配對學生t檢驗。 統(tǒng)計顯著性接受值為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者與動脈段的特征 臨床資料見表1。死亡原因：創(chuàng)傷8例，感染6例，自殺1例。

表1 15例患者特征

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 Micro-CT 資料 非狹窄和非鈣化狹窄斑塊VV空間密度顯著高于正常和鈣化狹窄斑塊段(表2)。鈣化斑塊段 VV密度與正常段相似。與正常斑塊和鈣化斑塊段比，這些數(shù)據(jù)也可理解為非狹窄和非鈣化斑塊中VV血管面積分數(shù)和VV內(nèi)皮表面分數(shù)顯著高于正常斑塊和鈣化斑塊段。 將血管壁內(nèi)所有VV內(nèi)皮表面加起來，接近45%～67%鈣化主腔內(nèi)皮表面通過非狹窄和非鈣化狹窄斑塊血管壁上的VV，顯著高于正常段的17%。雖然，鈣化狹窄斑塊段與正常段比，VV密度和分數(shù)無明顯差異， 在32%的情況下，鈣化斑塊通過VV獲得的內(nèi)皮交換表面仍明顯多于正常血管壁(表2)。與所有其他節(jié)段相比，非鈣化性狹窄斑塊節(jié)段的外/內(nèi)VV比值明顯高于其他節(jié)段，與正常節(jié)段比，非狹窄斑塊的比例較高。

表2 Micro-CT和組織學分析

注：*與正常比較，P<0.01；#與正常比較，P<0.001；A與非狹窄斑塊比較，P=0.001；B與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.05；C與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.01；D與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.001。

2.3 組織學 van Kossa(鈣沉積),Mallory’s(鐵、含鐵血黃素) 和 血型糖蛋白A染色(紅細胞碎片)可識別斑塊內(nèi)出血，這些出血可能是通過非鈣化和鈣化斑塊的滋養(yǎng)血管破裂(圖2和圖3)。有趣的是，斑塊鈣化與鐵和血型糖蛋白A染色的關(guān)系提示復發(fā)斑塊內(nèi)出血與斑塊鈣化有關(guān)聯(lián)(圖2)。VV密度與鈣化面積負相關(guān)(r=0.42,P<0.001,圖4)。

VV的進一步表征顯示內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)染色，炎癥標記物為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)而不是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF,圖4)。不同斑塊類型之間上述染色無顯著差異，除了病變冠狀動脈段內(nèi)VV TNF-α染色趨于更高的陽性外。

2.4 血型糖蛋白A和鐵評分 如圖3和表2，非鈣化狹窄斑塊段和非狹窄段比正常段和鈣化斑塊段血型糖蛋白A分值高。 VV密度和鐵評分與VV密度和血型糖蛋白A評分的 Kendall-Tau-brank 相關(guān)系數(shù)分別為 0.65 (P<0.01) 和0.58 (P<0.01)。

注：為了進一步描述冠狀VV的特征，圖A：VV 的H&E染色，圖B：eNOS染色，圖C：TNF-α，圖D：VEGF。雖然 VV內(nèi)皮細胞表達eNOS和TNF-α，但未見 VEGF表達。

3 討論

本研究顯示不同階段粥樣硬化人體冠狀動脈的滋養(yǎng)血管分布形式有顯著差異。非狹窄斑塊段動脈滋養(yǎng)血管密度較高，非鈣化狹窄斑塊段則進一步增加。 總之，非狹窄和狹窄斑塊新生滋養(yǎng)血管與斑塊內(nèi)出血的組織學標志相關(guān)。不過，一旦斑塊明顯鈣化，VV密度顯著減少與正常段無差異水平。 事實上，VV密度和鈣化動脈段鈣化面積負相關(guān)。可是，與正常段相比，鈣化斑塊段具有較高的血型糖蛋白 A和鐵評分，表明過去的斑塊內(nèi)出血。 因此，本研究進一步支持外膜新生滋養(yǎng)血管和動脈粥樣硬化進展和并發(fā)癥之間有關(guān)聯(lián)。

動脈粥樣硬化過程在血管樹表面分布具有異質(zhì)性，正如觀察尸體解剖和冠狀動脈造影T及血管內(nèi)超聲檢查一樣[14]。 這種不均勻表達的機理可以部分地用分岔區(qū)和曲線區(qū)不同的剪應力來解釋[15]。然而，血流動力學機制可能不能完全解釋斑塊在動脈段內(nèi)甚至在同一橫截面上分布的異質(zhì)性。因此， 確定斑塊啟動和進展及鈣化的共同因素就顯得尤為重要，這樣可以準確評價斑塊負擔， 修改疾病的自然歷史。應用 micro-CT，已經(jīng)證明人體和豬循環(huán)，不同血管床的外膜滋養(yǎng)血管密度不均質(zhì)性，與動脈粥樣硬化敏感性相關(guān)[11-12]。另外，研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇豬冠狀動脈比正常豬的VV密度增加，提示外膜滋養(yǎng)血管在早期動脈粥樣硬化重塑過程中起重要作用，這些可能發(fā)生于血管功能改變和斑塊形成之前。

輕微動脈粥樣硬化血管外膜呈現(xiàn)VV增生，結(jié)果增加VV數(shù)量和密度。根據(jù)3D分析，VV新生血管在外部VV水平明顯，動脈粥樣硬化過程中外部VV和內(nèi)部VV的比例<1，雖然文獻報道內(nèi)部VV生長受新內(nèi)膜形成刺激，可能是由于組織對氧氣的需求增加[9]。這種外膜重構(gòu)在明顯斑塊內(nèi)進一步增加。雖然新生的VV可作為對抗血管壁缺血的補償機制，廣泛VV網(wǎng)可能作為巨噬細胞和炎癥因子進一步進入的管道，可能潛在地促進炎癥和斑塊形成過程。事實是，血管生成抑制降低斑塊內(nèi)和滋養(yǎng)血管周圍巨噬細胞。

應用免疫組織化學對VV進一步觀察，顯示所有斑塊類型的eNOS表達、特別是病變段的TNF-α增加，研究未觀察到VEGF表達, 可能受到樣本年齡和加工方法影響。伴隨動脈粥樣硬化的新血管形成過程，致使許多新血管形成，從而增加斑塊內(nèi)出血的可能性。 新生微血管的彎曲和脆弱也促進了這一過程。斑塊內(nèi)出血與壞死核大小和冠狀動脈斑塊不穩(wěn)定性增加相關(guān)[6]。然而，最終斑塊破裂之前，血液產(chǎn)物在斑塊間質(zhì)內(nèi)沉積可能對進一步刺激炎癥過程有作用，其次是組織和纖維化，最終導致鈣沉積。

冠狀動脈鈣化是動脈粥樣硬化的病理特征，與斑塊負擔相關(guān)，與阻塞的程度無關(guān)。識別和量化動脈鈣化是預測心血管風險的可靠方法，特別是調(diào)整年齡和性別時的鈣化評分。 動脈鈣化開始于動脈粥樣硬化早期階段，代表礦化和羥基磷灰石晶體沉積的活性過程[2]。 此外，近期研究表明微鈣化與斑塊易損及正向重塑相關(guān)[5]。然而，鈣化過程機制和起源，是否為損傷即炎癥的一部分，或是涉及包括成骨內(nèi)皮祖細胞修復過程的一部分[6]，仍然有待研究。