血清抗bFGF自身抗體在活動期自身免疫性疾病中的檢測價值分析

毛洪博， 孟凡杰， 譚婷婷

(1.武漢科技大學天佑醫院檢驗科， 湖北 武漢 430064 2.山東省濰坊市益都中心醫院檢驗科， 山東 濰坊 262500)

自身免疫性疾病多由機體耐受遭到破壞后，免疫系統效應細胞或效應分子對固有的自身抗原產生病理性免疫應答，從而攻擊正常的細胞、組織或器官所致[1]，通常認為與女性、家族史、誘病環境暴露等因素密切相關[2]。活動期自身免疫性疾病患者可為初次發病或已病復發，需積極采取有效干預措施改善其預后，此階段其體內炎癥反應較為活躍，疾病臨床特征明顯，且外周血中可檢測出高效價自身抗體及自身反應免疫細胞[3]。迄今為止，臨床已發現較多導致自身免疫性疾病的標志抗體，如系統性紅斑狼瘡(SLE)的抗雙鏈DNA抗體、抗小核糖核蛋白抗體[4]，類風濕性關節炎(RA)的抗絲聚蛋白抗體，干燥綜合征(SS)的抗SS抗原B抗體，已令臨床診治及病理研究工作受益頗多。然而近年來有研究發現堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)能廣泛參與細胞因子調控[5]，并因此影響自身免疫性疾病發展進程，因此，有必要對其自身抗體在自身免疫性疾病中的表達情況作出分析，本研究取得一定成果，現作如下報道。

1 資料與方法

1.1一般資料:回顧性分析2016年7月至2019年6月期間，武漢科技大學天佑醫院收治的139例活動期自身免疫性疾病患者臨床資料，納入標準:①符合對應自身免疫性疾病相關診斷標準[6]；②根據疾病活動度評分(DAS)確認處于活動期[7]；③年齡≥18歲。排除標準:①合并原發性腎病、急慢性感染性疾病或惡性腫瘤；②妊娠期婦女；③臨床資料不完整。其中男性32例，女性107例；年齡為23～87歲，平均(52.54±9.21)歲；SLE 61例、SS 42例、RA 23例、其他類型13例。并將46例同期入院體檢的健康人群作為對照(納入標準:自發入院體檢且已完善血常規、血生化、尿便常規、腹部超聲等基本項目，基本體檢項目結果顯示不存在嚴重器質性疾病；排除標準:存在手術史，有糖尿病、甲狀腺疾病等慢性病史)，其中男性9例，女性37例；年齡為22～85歲，平均(52.05±8.94)歲。性別構成、年齡與納入患者比較均無統計學意義(P>0.05)。

1.2檢測方法:常規采集受試者肘靜脈血3mL，低溫下靜置凝血反應30min，與3500r/min轉速下離心15min，提取上清保存于-80℃冰箱；檢測前將血清樣品統一取出置于4℃冰箱內緩慢融化，參照相關文獻所得結論制備或選取酶聯免疫吸附試驗(ELISA)所需試劑與材料[8]，取bGFG標準品，以pH為9.8的碳酸鹽緩沖液稀釋至50mg/mL，100μL/孔加入采用海門市三和華興實驗玻璃儀器廠生產的96孔板(每個血清標本平行設置3孔)，37℃培養箱溫育1h后，置入4℃冰箱內過夜；傾去液體后拍干，以pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)+2g/L白明膠+10g/L牛血清白蛋白(BSA)配制為封閉液，加入200μL/孔，37℃培養箱溫育1h；傾去封閉液后拍干，以含有0.05%吐溫-20的PBS作為洗滌液，洗滌3min×5次；加入被PBS(pH=7.4)以1:40稀釋的血清樣本100μL/孔作為一抗，37℃培養箱溫育1h；傾去液體后拍干，洗滌3min 7次，加入1:3×104稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人免疫球蛋白(Ig)G或羊抗人I gM作為二抗，37℃培養箱溫育1h；傾去液體后拍干，洗滌3min 7次，加入新配鄰苯二胺顯色液100μL/孔，顯色10min后加終止液，送入酶標儀，在492nm波長位置測定每孔吸光度，3孔平行數據取均值，以健康人群樣本吸光度平均值+2×標準差為陽性界定值進行滴度測算。

1.3統計學方法:所得數據均錄入統計學軟件SPSS20.0進行處理，計數資料以例數表示，計量資料經由Kolmogorov-Smirnov正態性檢與Bartlett方差齊性檢驗驗，均已證實具備方差齊性且近似服從正態分布，因此以平均數±標準差表示，不同患病類型間比較采用單因素方差分析(one way-ANOVA)，對分析結果有統計學意義的指標進一步采用LSD-t檢驗逐一與對照樣本比較，不同腎損害情況間比較采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson相關系數模型，選擇雙側顯著性檢驗，返回相關系數(r)、置信區間(95%CI)及P值；預測效能評估采用受試者工作特征(ROC)曲線，獲取曲線下面積(AUC)、95%CI、敏感度、特異度、cut-off值等參數，均以α=0.05為檢驗水準，P<0.05提示有統計學意義。

2 結 果

2.1不同患病類型患者血清自身抗體水平比較:活動期SLE、SS、RA、其他類型自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平均明顯高于健康人群，且RA患者明顯高于SLE患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同患病類型患者血清抗bFGF-IgG抗體 抗bFGF-IgM抗體水平比較

注:與健康人群比較，*P<0.05

2.2不同腎損害情況患者血清自身抗體及UAER水平比較:活動期自身免疫性疾病腎損害患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體及UAER水平均明顯高于非腎損害患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同進展階段患者血清抗bFGF-IgG抗體抗bFGF-IgM抗體及UAER水平比較

2.3相關性分析:Pearson相關系數模型顯示，活動期自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平與UAER水平均表現出顯著正相關性(r>0，P<0.05)，見表3。

表3 Pearson相關系數模型統計參數

2.4預測效能分析:血清抗bFGF-IgG抗體預測活動期自身免疫性疾病患者腎損害的ROC曲線AUC為0.745(0.664～0.815)與抗bFGF-IgM抗體的0.712(0.629～0.785)比較無統計學意義(DeLong Z=0.964，P=0.531)，預測敏感度分為別83.33%、91.67%，特異度分別為64.08%、61.17%，cut-off值分別為208.01×10-3、224.79×10-3，見圖1。

圖1 血清自身抗體預測腎損害的ROC曲線

3 討 論

自身免疫性疾病患者由于體內存在豐富的免疫復合物及類風濕因子，非特異性結合的能力相較于健康人群更高，因此通過間接法血清自身抗體檢測結果通常偏高，有必要建立試驗體系進行優化，以提高檢測的精確性。既往研究發現，針對bFGF而言，其等電點在9.6左右，因此其包被條件需選取偏離該值且接近普通體系的溶液酸堿度，已證實在pH為9.8時可相較于9.2、10.0獲得更特異性反應最強的試驗結果，需注意確保抗原反應達到飽和，如再增加bFGF濃度，則將提高空白孔背景信號。bFGF作為體內分布廣泛的細胞因子，幾乎表達于所有來源于中胚層、神經外胚層的組織中，尤其內皮細胞表達活躍，由于在細胞外間質能長期穩定存在，有一定幾率刺激免疫系統產生自身抗體。本研究結果顯示，活動期SLE、SS、RA、其他類型自身免疫性疾病患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體水平均顯著較健康人群更高，且RA患者顯著較SLE患者更高，這說明自身免疫性疾病患者體內抗bFGF自身抗體表達相對活躍，該物質可能參與疾病發生與發展過程，其中RA患者表達尤為旺盛，究其原因可能與抗bFGF自身抗體加重軟骨損害有關。相關專家表示，RA患者產生膠原蛋白、纖絲蛋白相關自身抗體或磷脂抗體將特異性增強其脾臟、關節翳募集特異性T淋巴細胞及B淋巴細胞產生免疫反應，上調組織對細胞因子浸潤的敏感性，從而導致關節損傷程度增加。

既往臨床檢測多將bFGF作為腫瘤組織中，與血管內皮生長因子(VEGF)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)共同調控局部微血管形成，直接對其生物學行為及患者預后構成顯著性影響。但近年來也有學者發現，bFGF與Ⅰ型膠原表達增高是腎單位萎縮、消失及纖維組織增生面積擴大的表現，可促進細胞因子釋放，對細胞間相互作用及細胞外基質產生刺激，導致腎間質成纖維細胞過度激活、表型轉換并異常增生，檢測水平與病變程度存在明顯相關性，甚至更先于尿素氮、血肌酐、尿酸等常見腎功能指標實現早期預測，對臨床盡早掌握慢性腎臟疾病患者進行性纖維化導致腎功能衰竭的病程進展有重要意義。本研究中，活動期自身免疫性疾病腎損害患者血清抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體及UAER水平均顯著較非腎損害患者更高，且均與UAER表現出顯著正相關性，其滴度水平分別≥208.01、224.79時，可高風險提示為自身免疫性疾病患者合并有腎損害，這說明活動期自身免疫性疾病患者發生腎損害過程與抗bFGF抗體密切相關，具體機制仍不十分明確，有待臨床進一步深入探索。趙鳳芝等[9]認為，運用異常表達抗bFGF抗體情況，能監測疾病發生情況，評估其與抗原中和、競爭抑制細胞增殖等作用，可為腫瘤性疾病控制提供治療思路，盡管已有鼠抗人、兔抗人的多克隆或單克隆抗bFGF抗體上市，但其療效仍需要大量臨床研究加以證實。

綜上所述，抗bFGF-IgG抗體、抗bFGF-IgM抗體可能參與到各種活動期自身免疫性疾病發生、發展病理機制中，尤其與腎損害作用密切相關，臨床早期檢測可為預后評估及診治策略提供參考。