自身免疫病病人外周血NK細胞檢測的意義

陳 琳,呂 程,孟天犁,姜國平,李慧穎,呂英春,江 濤,孔令環

(吉林省人民醫院 風濕免疫科，吉林 長春130021)

自身免疫病包括系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風濕關節炎、風濕熱、多發性肌炎/皮肌炎等。是風濕性疾病中的一組疾病。其特點為臨床表現多種多樣，多器官受累，重要器官受累可危及生命。應用皮質醇、類固醇和免疫抑制劑治療有效。病因未明，與遺傳、免疫、感染等因素有關。以SLE為例，大量研究[1]表明，多種因素通過影響細胞免疫功能紊亂而致病，SLE存在T、B細胞功能紊亂，但SLE患者外周血淋巴細胞亞群改變與疾病的活動性之間的關系尚有爭論，多數學者認為T淋巴細胞功能的紊亂引起B淋巴細胞的高度活化而產生多種自身抗體是本病發生和發展主要因素。

自然殺傷(natural killer，NK)細胞在機體正常的免疫、防御機制中起重要作用。本研究采用流式細胞術檢測外周血NK細胞數量及其胞膜活化性受體NKG2D(CD314)和抑制性受體NKG2A(CD159)以及穿孔素、顆粒酶-β的表達，探討NK細胞在自身免疫病發病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取我院2018年1月-12月自身免疫病住院病人29例。其中女14例，男15例。年齡23-84歲。類風濕關節炎8例，強直性脊柱炎4例，銀屑病關節炎6例，炎癥性腸病關節炎1例，系統性紅斑狼瘡2例，風濕性多肌痛1例，結締組織病1例，ANCA相關性血管炎4例，干燥綜合征2例。對照組18例，均為健康體檢者，男10例，女8例，年齡31-53歲。

1.2 試劑、儀器和方法

1.2.1購買美國Beckman Coulter 公司單抗 鼠抗人CD159( (NKG2A)- PE、CD314(NKG2D)-FITC,CD3-ECD、CD16-PC5、CD56-PC5，顆粒酶granzymeβ-PE,穿孔素 perforin-FITC，及溶血劑、破膜劑。

1.2.2流式細胞儀為美國貝克曼公司的多參數EPICS XL型流式細胞儀，應用EXPO32ADCXL4 Color 軟件分析，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，結果以百分率表示。

1.2.3流式細胞術分析方法 采用微量全血直接免疫熒光技術標記NK細胞。檢測胞模蛋白： Falcom管加入抗體CD16- PC5、CD56- PC5、CD3-ECD各10 μl、NKG2A- PE 20 μl、NKG2D-FITC 5 μl用于標記NK細胞和NKG2A、NKG2D；再加100 μl外周血，充分混勻。孵育，加入溶血劑500 μl，混勻，室溫避光10 min，1 500 r/min離心5min,棄上清，加500 μl PBS，上機檢測。檢測胞質蛋白：Falcom管加入抗體CD16- PC5、CD56- PC5、 CD3-ECD各10 μl，再加100 μl外周血，室溫避光孵育15 min,加入A液50 μl，避光15 min，加入PBS液1 ml洗1次，離心棄上清，加入50 μl B液，依次加入granzyme β- PE、 perforin-FITC單抗各5 μl，4℃避光孵育15 min，加PBS液1 ml洗滌2遍，加500 ul PBS，上機檢測。

1.3 統計學

2 結果

2.1 自身免疫病病人外周血NK細胞占淋巴細胞百分比

自身免疫病病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞在治療前和治療后均低于正常對照組，但無明顯統計學差異；治療前外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細胞在與治療后相比，無明顯統計學差異，見表1。

2.2 自身免疫病病人NK細胞膜活化性受體、抑制性受體表達

自身免疫病病人NK細胞膜活化性受體NKG2D(CD314)的表達在治療前和治療后均低于正常對照組(P≤0.001)；治療后NK細胞膜活化性受體NKG2D(CD314)的表達較治療前上升，但無明顯統計學差異，見表1。

自身免疫病病人NK細胞膜抑制性受體NKG2A(CD159)的表達在治療前和治療后與正常對照組相比，均無明顯統計學差異；治療前NK細胞膜抑制性受體NKG2A(CD159)的表達與治療后相比，無明顯統計學差異，見表1。

2.3 自身免疫病病人NK細胞穿孔素、顆粒酶-β的表達

自身免疫病病人NK細胞穿孔素的表達在治療前和治療后與正常對照組相比，均無明顯統計學差異；治療前NK細胞穿孔素的表達與治療后相比，無明顯統計學差異,見表1。

自身免疫病病人在治療前和治療后NK細胞顆粒酶-β的表達與正常對照組相比，均顯著減低(P<0.05)；但治療前NK細胞顆粒酶-β的表達與治療后相比，無明顯統計學差異，見表1。

表1 外周血NK細胞及其表面受體的表達

與對照組相比較；※P<0.05 治療后與治療前相比較，&P<0.05

3 討論

免疫功能失調是自身免疫性疾病發病機制的關鍵環節。(CD3-CD16+CD56+)NK細胞是天然免疫系統的重要組成部分，在抗病毒感染免疫、腫瘤免疫、移植排斥反應及免疫調節中起十分重要的作用[2]。

NK細胞是來源于骨髓的一類淋巴細胞，因胞內含有大量嗜天青顆粒，也被稱為大顆粒淋巴細胞(large granular lymphocyte，LGL)。NK細胞廣泛存在于骨髓、肝、子宮、脾、肺、次級淋巴組織(secondary lymphoid tissue，SLT)、黏膜相關淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)及胸腺，通常占人體外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC )的5%-15%，僅次于T、B細胞之后[3]。作為天然免疫的重要組成部分，NK細胞是最早到達炎癥位點的細胞之一，起到免疫監視作用，主要通過監視細胞膜表面的MHC class I分子的含量來識別發生溶解改變或是受到病毒感染的自體細胞，當靶細胞膜表面低表達MHC class I分子時，NK細胞的抑制因子降低，NK細胞活化，釋放大量細胞毒性顆粒(如：顆粒酶，穿孔素)以及炎性細胞因子(如TNF、IFN-γ)，導致靶細胞死亡。同時在適應性免疫中，NK細胞也參與清除自身反應性T、B細胞[4]。

NK細胞為繼T細胞、B細胞的第3類淋巴細胞，在天然免疫和獲得性免疫中均發揮重要作用[5，6，7]。NK細胞表面受體對于NK細胞發揮自身功能活性起到重要作用，其中NKG2家族是近年來研究關注較多及研究較深入的一類受體，包括NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2H 等[8]。根據功能可分為抑制性受體和活化性受體2大類。其中NKG2A是NKG2家族中唯一的抑制性受體，可以識別自身MHC class I，進而阻止NK細胞的活性[9]。人NKG2D是NK細胞表面的活化性受體，能與MHC class I鏈相關分子A和B結合，NKG2D受體通常不表達于正常細胞上，但是可以在腫瘤細胞或被感染的細胞中過表達。在正常情況下，NKG2A，NKG2的表達水平處于平衡狀態，共同調節NK細胞的活性。抑制性NK細胞受體的自身抗體和NKG2A的存在可以極度提升 NK 細胞功能導致體內自身抗體水平增高最終刺激自身免疫反應[10，11]。關于RA患者外周血中NK細胞表面受體的表達水平，研究不一致。Vastert等[12]發現RA患者外周血中NKG2A表達水平低于健康人；另有研究表明RA患者NKG2A+NK細胞的表達水平升高，而NKG2D的表達降低[5]。本研究中，NKG2D的表達降低(P≤0.001)，NKG2A的表達較正常對照組雖然無明顯統計學差異，但表達高于正常組，可能與樣本量不足有關。NKG2D的表達降低，導致NK細胞活化功能受到抑制，不能有效發揮堆免疫效應細胞的殺傷作用，從而導致自身免疫病的發生。

NK細胞通過消除活化的免疫效應細胞執行其免疫調節過程，關于此機制，Jacobs等[13]已有研究證實活化的NK細胞可以通過分泌穿孔素，顆粒酶-β等，參與細胞凋亡通路進一步消除機體活化的效應細胞，例如CD4+T細胞等。穿孔素又稱孔道形成蛋白，是NK細胞核細胞毒性T細胞特有的具有殺傷功能的蛋白質。殺傷細胞與靶細胞接觸，殺傷細胞的胞漿顆粒即向兩個細胞接觸部位移動，然后被釋放“分泌”到細胞外。穿孔素存在于這種顆粒中，并在Ca2+存在下在靶細胞膜上形成穿膜孔道，導致靶細胞溶解[14]。本研究表明，自身免疫病病人NK細胞顆粒酶-β的表達與正常人相比，顯著降低。這與Vastert等[12]關于幼年特發性關節炎患者的研究結果一致。然而相反的是，Ashish 等的研究結果顯示，RA患者外周血中NK 細胞表達的顆粒酶-β水平是升高的。自身免疫病病人NK細胞穿孔素的表達與正常人相比，無明顯差異。因此，顆粒酶、穿孔素在風濕免疫病的作用機制需要進一步研究。

自身免疫病病人外周血NK細胞占淋巴細胞百分比、NK細胞膜活化性受體、抑制性受體表達、NK細胞穿孔素、顆粒酶-β的表達在治療前后無明顯差異，考慮免疫抑制劑對NK細胞影響較小。

綜上，外周血NK細胞的膜活化性受體NKG2D和顆粒酶-β表達減少可能與自身免疫病的發生、發展有關。可進一步研究NK細胞在自身免疫病的發病和治療作用，尋找治療自身免疫病的新方法。