熒光定量核酸擴增檢測技術在肺結核快速診斷及利福平耐藥檢測中的效果觀察

張偉

（湖北省丹江口市疾病預防控制中心 湖北 丹江口 442700）

結核分枝桿菌感染是引起結核病的主要原因，其中以肺部感染最為多發。當前，結核分枝桿菌培養是結核病實驗室診斷的金標準，其陽性率高，但檢測周期過長，無法滿足臨床早期和快速診治的需求，在基層醫院開展困難，且可能延誤治療，因此亟需一項快速且準確的結核病診斷技術[1]。實時熒光定量核酸擴增檢測是一種分子信標檢測法，能作為結核分枝桿菌護利福平耐藥的檢測手段。本研究以我院近期收治的疑似肺結核患者為例，探討了實時熒光定量核酸擴增檢測技術在肺結核診斷與利福平耐藥實驗中的應用效果。

1.資料與方法

1.1 一般資料

將我院2018 年6 月—2020 年6 月期間收治的500 例可疑肺結核者/可疑耐藥肺結核者作為觀察對象，男性273 例，女性227 例，年齡43 ～71 歲，平均（59.34±5.78）歲。

納入標準：①可疑肺結核者：健康體檢是發現肺部陰影、伴隨咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀或咯血兩周以上；有低熱、盜汗、乏力等結核中毒癥狀。②可疑耐藥肺結核者：既往抗結核治療失敗和復發者。

1.2 方法

1.2.1 痰標本收集 采集患者三份痰液標本，每份標本量≥2ml，分別用于痰涂片、實時熒光定量核酸擴增檢測、固體羅氏培養以及液體分枝桿菌培養。

1.2.2 抗酸染色涂片 采取萋-尼式染色顯微鏡檢查，操作流程嚴格遵循《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》。判定標準：連續觀察300 個不同視野，均未發現抗酸桿菌判定為陰性；抗酸桿菌數1 ～8 條/300HP 判定為陽性；連續觀察300 視野，3 ～9 條/100HP 為抗菌陽性（+）連續觀察100 視野，1 ～9 條/10HP 為陽性（++）；1 ～9 條/HP 為陽性（+++）；≥10 條/HP 為陽性（++++）[2]。

1.2.3 分歧桿菌液體培養 將痰液標本置入50ml 離心管，加入2%N-乙酰-L 半胱氨酸-氫氧化鈉前處理液，以標本實際性狀為依據，處理液加入量為標本體積1 ～2 倍，進行震蕩確保標本充分均勻，試管在室溫環境下靜置15min后，加入50ml PBS（PH值6.8），充分混勻后采用離心機進行離心，轉數3000×g，時間15min。離心完成后將上清棄除，余下標本內加入1 ～3ml PBS（PH 值6.8），充分混勻，滴管吸取經處理標本0.5ml 置入MGIT960 培養管，并嚴格按照操作MGIT 960 說明完成剩余流程[3]。

1.2.4 分歧桿菌液體藥物敏感試驗 將檢測陽性的菌液按照MGIT960 液體藥敏試驗操作進行檢驗，檢驗藥物包括利福平、異煙肼、鏈霉素以及乙胺丁醇，藥物濃度：利福平1μg/ml；異煙肼0.1μg/ml；鏈霉素1μg/ml、乙胺丁醇5μg/ml。

1.2.5 實施熒光定量核酸擴增技術檢測 根據檢測系統說明書對痰液標本進行前處理后，用移液管取2ml 經處理標本加入樣本匣中，緩慢倒入避免氣泡。開啟分析儀完成自檢，掃描樣本匣條碼并輸入樣本信息，將樣本匣送入檢測模塊后關閉艙門，系統自動完成結果判讀。檢測結果等級分為：陰性、極低含量（Ct 值＞28）；低含量（Ct 值22 ～28）；中等含量（Ct 值16～22）；高含量（Ct 值＜16）。耐藥檢查結果以δCt 值為依據，分為：利福平敏感（δCt 值≤4）；利福平耐藥（δCt 值＞4）；不確定（結果無法判讀）[4]。

1.3 統計學分析

應用統計學SPSS18.0 對患者的資料進行統計分析，計數資料以（%）表示，χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 三種檢測方式效能對比

臨床診斷結果：321 例肺結核確診，排除肺結核179 例。以該結果為金標準，實時熒光定量核酸擴增檢測真陽性245 例，假陽性1例，真陰性178，假陰例76例。敏感度為76.32%（245/321）；特異度為99.44%（178/179）。抗酸染色涂片檢測真陽性142 例，假陽34；真陰145；假陰179 例；敏感度為44.24%（142/321），特異度為81.01%（145/179）；液體培養檢測真陽性274 例，假陽性0 例；真陰性179 例，假陰性47 例，敏感度為85.36%（274/321），特異度為100%（179/179）。實時熒光定量核酸擴檢測敏感度與液體培養對比差異無統計學意義（P＞0.05），實施熒光定量核酸擴增檢測敏感度明顯高于抗酸染色圖片，對比差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三種檢測方式在肺結核診斷中的敏感度與特異度對比

2.2 實時熒光定量核酸擴增檢測檢驗利福平耐藥性的效能

所有納入研究的標本中，痰結核分歧桿菌陽性共340 份，其中3 例實施熒光定量核酸擴增檢測陰性，3 例檢測不確定，2例無液體藥敏試驗結果，最終納入332 例進行分析，將液體培養結果作為金標準，實施熒光定量核酸擴增檢測的敏感度與特異度分別為82.35%（14/17）100.00%（315/315），見表2。

表2 實施熒光定量核酸擴增檢測利福平耐藥性效能

3.討論

結核病及其耐藥性的快速診斷是當前臨床工作的一大挑戰，同時也是臨床研究熱點。抗酸染色涂片鏡檢操作簡便且快捷，是資源匱乏地區和基層醫院開展結核病診斷的重要手段，其能直接從臨床標本制備涂片，但陽性率低，敏感度也較差[5]。

本次研究提示，將臨床標本作為金標準，實時熒光定量核酸擴增檢測對分枝桿菌檢測的敏感度與液體培養相當，明顯高于染色涂片鏡檢，在利福平耐藥實驗中敏感度與特異度均高，證實了實時熒光定量核酸擴增檢測技術在肺結核快速診斷中的應用價值高，值得應用。