葫蘆茶苷對四氯化碳致肝纖維化模型小鼠的保護作用及機制研究

唐愛存 韋燕飛 劉喜華 王明剛 盧秋玉

中圖分類號R285.5;R575.2;R965.2

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0190-06

DOI

10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.12

摘要 目的：研究葫蘆茶苷對四氯化碳（CC14）致肝纖維化模型小鼠的保護作用，并探討其可能機制。方法：將昆明種小鼠隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.2 mg/kg）和葫蘆茶苷低、中、高劑量組（3、6、12 mg/kg），每組10只。除正常組小鼠腹腔注射橄欖油外，其余各組小鼠均腹腔注射10%CC14橄欖油溶液（5mL/kg）以復制肝纖維化模型，每周2次，連續8周。自第3周起，各給藥組小鼠灌胃相應藥物，正常組和模型組小鼠均灌胃等體積2%羧甲基纖維素鈉溶液，每日1次，連續6周。采用酶聯免疫吸附測定法檢測各組小鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、透明質酸（HA）、白細胞介素6（IL-6）的含量;采用分光光度法、逆轉錄一聚合酶鏈反應法、Westem blotting法分別檢測其肝組織中羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量，I型膠原（C01-I）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、TIMP-2 mRNA以及基質金屬酶2（MMP-2）、轉化生長因子β1（TGF-β1）蛋白的表達情況。結果：與正常組比較，模型組小鼠ALT、AST、HA、IL-6、MDA、Hyp含量，C01-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA以及MMP-2、TGF-β1蛋白的表達水平均顯著升高，SOD、GSH-Px含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠ALT、AST、HA、IL-6、MDA、Hyp含量，C01-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA以及MMP-2、TGF-β1蛋白的表達水平均顯著降低，SOD、GSH-Px含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：葫蘆茶苷對肝纖維化模型小鼠具有肝保護和肝纖維化抑制的作用，其機制可能與抑制脂質過氧化和膠原蛋白合成，下調C01-I、TIMP-I、TIMP-2 mRNA以及MMP-2、TGF-β1蛋白的表達等有關。

關鍵詞 葫蘆茶苷;四氯化碳;肝纖維化;脂質過氧化;膠原蛋白;基質金屬酶;金屬蛋白酶組織抑制因子;轉化生長因子β1;小鼠

肝纖維化（Hepatic fibrosis）是一種肝臟內纖維結締組織異常沉積的病理過程，其并非獨立疾病，而是多數慢性肝病共同的病理特征[1]。當肝臟細胞發生壞死或受到炎癥刺激時，肝臟中膠原蛋白等細胞外基質的增生與降解可能會失去平衡，從而導致肝纖維化的形成;若纖維化的過程長期持續就會發展成肝硬化，甚至是肝癌[2]。目前，現有西醫治療肝纖維化的方法療效欠佳，且復發率高、副作用較大[3]。因此，尋找和研究緩解甚至逆轉肝纖維化及肝硬化的有效手段具有重要的臨床意義。

葫蘆茶為豆科植物葫蘆茶[Tadehagi triquetrum（L.）Ohashi]的枝葉，是廣西常用壯藥，壯名“Gohuzluzcaz.”，主要分布于廣西、廣東、海南等地。該藥味苦、澀，性涼，具有清熱解毒、利濕退黃、消積殺蟲的功效，臨床上常用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、肺癰、黃疸肝炎、腸炎、風濕關節痛、小兒疳積等癥[4]。葫蘆茶苷（3，5-二羥基苯基-6-0-反式.對羥基肉桂酰基- β-D-葡萄吡喃糖苷）是從葫蘆茶乙醇提取物中分離得到的活性成分[5]。本課題組前期研究發現，葫蘆茶苷具有明顯的體外抗乙型肝炎病毒作用，其機制可能與激活Janus激酶/信號傳導及轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路有關[6];此外，該化合物還能通過激活核因子E2相關因子2（Nrf2）信號通路來減輕有害物質對肝細胞的損害，抑制肝細胞凋亡，對四氯化碳（CC14）致急性肝損傷模型大鼠具有明顯的保護作用[7-9]。然而，葫蘆茶苷對CC14致小鼠肝纖維化的抑制作用及其機制尚未見相關報道。為此，本課題組基于前期研究結果，以CCl4誘導建立小鼠肝纖維化模型，進一步探討葫蘆茶苷對肝纖維化的抑制作用及可能機制，以期為開發廣西特色抗肝纖維化壯藥提供實驗依據和理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

722S型可見光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）;TDL-5型臺式低速大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）;WH-1型微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器有限公司）;5810R型高速冷凍多用途離心機（德國Ep-pendorf公司）;Gel Doc 2000型凝膠成像分析系統、PAC-300型低壓電泳儀、9700型聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀、HD-4N型核酸蛋白測定儀、Model 450型自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）;5200型全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）;DY89-Ⅱ型勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

葫蘆茶苷對照品（純度：>98.0%）由本課題組從葫蘆茶[T triquetrum（L.） Ohashi]枝葉中分離所得，臨用前用2%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液稀釋，制成相應質量濃度的混懸液;秋水仙堿片（廣東彼迪藥業有限公司，批號：20181001，規格：0.5 mg）;丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-Px）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為20170801、20170601、20170801、20171221、20170601、20171022）;透明質酸（HA）、白細胞介素6（IL-6）試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號分別為N20012900、AK0017FEB22012）;FirstStrand cDNA Synthesis Kit（美國MBI公司，批號：00064478）;2xPCR Taq Mix（日本Takara公司，批號：9108）;兔抗小鼠基質金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體、兔抗小鼠轉化生長因子p.（TGF-β1）抗體（美國Abcam公司，批號分別為GR105729-I、GR121504-3）;小鼠β-肌動蛋白（β-actin）抗體（內參，無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號：18AV0315）;山羊抗小鼠免疫球蛋白G（lgG）=抗、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為112638、134529）;Trizol試劑、莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MIV）逆轉錄酶（美國Invitrigen公司）;瓊脂糖（西班牙Biowest公司）;十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠（ SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（北京百奧萊博科技有限公司）;增強化學發光法（ECI）顯色劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）;RIPA裂解液（含l%蛋白酶抑制劑）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;PCR擴增引物由上海英駿生物技術有限公司設計、合成;氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質量（20±2）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（桂）2014-0003。實驗室溫度為（20±2）℃，所有小鼠均自由進食、飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將昆明種小鼠60只隨機分為正常組、模型組、秋水仙堿組（陽性對照，0.2 mg/kg，劑量設置參照人等效劑量換算而得）以及葫蘆茶苷低、中、高劑量組（3、6、12 mg/kg，劑量設置參照本課題組前期研究結果），每組10只。所有小鼠禁食過夜后，正常組小鼠腹腔注射等體積橄欖油，其余各組小鼠均腹腔注射10%CC14橄欖油溶液（5mL/kg）以復制肝纖維化模型，每周2次，連續8周[10]。自第3周起，各給藥組小鼠均灌胃相應藥物，正常組和模型組小鼠均灌胃等體積2% CMC-Na溶液，每日1次，連續6周。

2.2 小鼠血清學指標檢測

末次給藥10 h后，所有小鼠均摘取眼球取血，分離血清，采用酶聯免疫吸附測定法（EIISA）以自動酶標儀檢測其血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.3 小鼠肝組織中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px含量檢測

小鼠取血后立即脫頸處死，剖取肝臟，于肝臟右葉相同部位取肝組織約0.1 g，置于含生理鹽水的勻漿器中，于冰浴中制備成10%肝勻漿。采用考馬斯亮藍法對肝組織蛋白進行定量后，采用分光光度法以可見光分光光度計檢測其肝組織中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px的含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.4 小鼠肝組織中I型膠原（Col-I）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、TIMP-2 mRNA表達水平檢測 取小鼠肝組織適量，采用Trizol法提取肝組織總RNA。取上述總RNA 2 μg，按First Strand cDNA Syn-thesis Kit說明書方法，在M-MLV逆轉錄酶作用下逆轉錄合成cDNA。以上述cDNA為模板，采用逆轉錄一聚合酶鏈反應法（RT-PCR）以PCR擴增儀進行擴增。反應體系（20 μL）：cDNA模板2μL，10 μmol/L的上、下游引物（序列見表1）各1μL，2xPCR Taq Mix 10 μL，用無酶水補至20 μL。反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30s，適宜溫度（Col-I：55℃;TIMP-1和TIMP-2：52℃）退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環;72℃再延伸10 min。反應結束后，取擴增產物2.OμL，進行瓊脂糖凝膠電泳（電壓：110V，時間：15 min），并置于凝膠成像分析系統上成像。采用Image-pro PlusV 7.0圖像分析，以目的基因和內參β-actin條帶的光密度（OD）值比值來表示目的基因mRNA的表達水平。上述試驗重復3次。

2.5 小鼠肝組織中MMP-2、TGF-β1蛋白表達水平檢測

采用Western blotting法檢測。取小鼠肝組織適量，加入RIPA裂解液（含l%蛋白酶抑制劑）1 mL，于4℃下裂解后，并于4℃下以12 000 r/min離心10 min。取上清液，采用BCA法測定蛋白含量，隨后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液適量，于95℃水浴中變性5 min。取變性后的蛋白進行SDS-PAGE電泳分離（電壓：80V，時間：30 min），電泳完成后轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入相應一抗（稀釋度均為1：1 000），4℃孵育過夜;用TBST溶液清洗5minx3次，加入二抗（MMP-2和TGF-β1加入山羊抗兔IgG二抗，β-actin加入山羊抗小鼠IgG二抗，稀釋度均為1：1 000），室溫孵育th后，用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗5minx3次，以ECL顯色后，置于全自動化學發光圖像分析系統上成像。使用QuantityOne4.6軟件分析，以目標蛋白與內參β-actin條帶的灰度值比值來表示目標蛋白的表達水平。上述試驗重復3次。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.O軟件對數據進行統計處理。計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 葫蘆茶苷對小鼠血清中ALT、AST、HA、IL-6含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠血清中上述指標的含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.2 葫蘆茶苷對肝組織中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著降低，而Hyp、MDA含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px含量均顯著升高，而Hyp、MDA含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 葫蘆茶苷對肝組織中Col-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中Col-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中上述指標的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.4 葫蘆茶苷對肝組織中MMP-2、TGF-β1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MMP-2、TGF-β1蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組小鼠肝組織中上述指標的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖1、表4。

4 討論

肝纖維化是肝硬化以及肝功能衰竭的共同病理基礎和必經階段，是影響慢性肝病進展的重要環節，因此肝纖維化的預防、治療乃至逆轉是阻止肝硬化發生的關鍵環節[11]。肝纖維化的形成機制復雜，目前認為是由于各種肝損傷因子引起肝細胞損傷、壞死、凋亡和肝組織炎癥反應，激活枯否細胞分泌多種細胞因子，與肝細胞、血小板及竇內皮細胞分泌的細胞因子、脂質過氧化物等化學遞質共同作用于肝星狀細胞（HSCs），后者被激活并轉變為肌成纖維細胞，從而發生表型及功能改變，通過旁分泌或自分泌基質，使肌成纖維細胞增殖，合成大量的膠原蛋白等細胞外基質[12]。有研究表明，活化HSCs的減少可逆轉肝纖維化，在抗病毒藥物治療病毒性肝纖維化、膽管引流治療膽汁淤積性肝纖維化以及肝臟移植等研究中，均發現肝纖維化的逆轉與活化HSCs的減少有關[13]。

CC14誘導肝纖維化小鼠模型是目前最常用的模型之一，具有操作性強、成功率高、重復性好等優點，其誘導肝纖維化的機制為CC14在體內經肝微粒體細胞色素P450酶依賴的單加氧酶系代謝后，分子中的C-CI鍵均裂，產生三氯甲烷自由基和氯自由基，上述自由基可攻擊肝細胞膜上的磷脂分子而造成脂質過氧化;同時，三氯甲烷自由基在體內能以最快的速度與分子氧形成三氯甲基過氧自由基，后者可直接引發肝細胞脂質過氧化，誘發肝細胞凋亡，且脂質過氧化物可進一步誘導炎癥反應、激活枯否細胞和HSCs，促進肝纖維化的發生和進展[14]。秋水仙堿是從植物秋水仙中提取的一種生物堿，廣泛應用于抗肝纖維化的動物實驗研究。研究表明，該化合物具有良好的抗肝纖維化作用，能抑制肝內儲脂細胞（結蛋白陽性細胞）的增殖和轉化，從而減少膠原蛋白合成及其在肝竇周圍的沉積，故本研究將其作為陽性對照藥物[15]。

血清中ALT、AST含量是評價肝細胞受損的基本指標，在CCI4致肝纖維化時，血清ALT、AST含量均有不同程度的升高[16]。HA是細胞外基質的主要成分之一，而細胞外基質的含量與肝纖維化程度成正相關。由此可見，HA升高是肝纖維化啟動的標志之一;若其含量持續升高，則提示肝纖維化并未得到有效控制[16]。有研究表明，IL-6由活化的HSCs分泌，能反饋性地促進HSCs的增殖，并使其處于持續活化的狀態[17]。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量均較正常組顯著升高，提示CC14可導致小鼠肝臟受損。經不同劑量葫蘆茶苷處理后，小鼠血清中上述指標的含量均顯著降低，提示該化合物具有保肝、抗肝纖維化的作用。

Hyp是膠原蛋白結構中特有的氨基酸成分，在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中含量極低;當肝纖維化發生時，膠原蛋白的含量明顯增加，且Hyp的含量與肝纖維化損傷程度成正相關[16]。SOD是體內清除自由基的關鍵酶，其水平的高低是衡量機體抗氧化能力強弱的重要因素㈣。MDA是主要的脂質過氧化終產物，其含量高低能反映機體內脂質過氧化的強度，間接反映出機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[18]。MDA本身具有細胞毒性，可進一步激活HSCs產生膠原蛋白[19]。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，可對抗并阻斷氧自由基對細胞造成的損害;但隨著機體內自由基水平的不斷上升，GSH-Px含量逐漸降低，故可作為評價肝硬化程度的又一重要指標[20]。本研究結果顯示，模型組小鼠肝組織中Hyp、MDA含量均較正常組顯著升高，而SOD、GSH-Px含量均較正常組顯著降低，提示肝纖維化模型復制成功。經不同劑量葫蘆茶苷處理后，各給藥組小鼠肝組織中Hyp、MDA含量均較模型組顯著降低，SOD、GSH-Px含量均較模型組顯著升高，提示葫蘆茶苷對肝纖維化模型小鼠的保護作用可能與抑制脂質過氧化和膠原蛋白合成有關。

Col-I是細胞外基質的另一主要成分，是肝纖維化過程纖維間隔形成的重要來源，因此其含量可反映肝膠原蛋白的合成情況[21]。TIMPs因能抑制纖維膠原蛋白的降解，在肝纖維化的發展過程中可能發揮著重要作用，其中TIMP-I由活化的HSCs分泌，其含量與活化HSCs的數量成正比，TIMP-2則可通過抑制細胞外基質降解來加速肝纖維化進程[22]。MMPs是一類能降解細胞外基質和基底膜成分的蛋白水解酶，MMP-2是其中的一種，在動物和人體內發揮著重要的生理和病理功能[23]。研究表明，MMP-2與HSCs的活化密切相關，其可通過降解Ⅳ型膠原蛋白支架結構，使HSCs被激活，從而參與肝纖維化的啟動[24]。TGF-β1是肝纖維化形成過程中的重要調控因子，可激活HSCs，并參與細胞外基質的生成[25]。研究指出，受損的肝細胞會釋放大量的TGF-β1，進而激活HSCs，后者可進一步促進TGF-β1的分泌，導致肝纖維化損傷進一步加重[25]。本研究結果顯示，模型組小鼠肝組織中Col-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA以及MMP-2、TGF-β1蛋白的表達水平均較正常組顯著升高，提示肝纖維化模型復制成功。經不同劑量葫蘆茶苷處理后，各給藥組小鼠肝組織中上述指標的表達水平均較模型組顯著降低，提示其可通過顯著抑制膠原蛋白的合成與沉積、抑制HSCs活化等途徑來發揮對肝纖維化的抑制作用。

綜上所述，葫蘆茶苷對肝纖維化模型小鼠具有肝保護和肝纖維化抑制作用，其機制可能與抑制脂質過氧化和膠原蛋白合成，下調Col-I、TIMP-1、TIMP-2 mRNA以及MMP-2、TGF-β1蛋白的表達等有關。但肝纖維化的發生機制極其復雜，本研究僅初步探究了其部分可能機制，其相關信號轉導等分子機制尚有待后續研究進一步完善。

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（收稿日期：2019-05-27修回日期：2019-10-12）

（編輯：張元媛）

△基金項目：廣西自然科學基金資助項目（ No.2015GXNSF-BA139126）;廣西衛生計生委自籌經費科研課題（No.22015481，No.220170303）;廣西2018年全國中藥特色技術傳承人才培訓項目（No.桂中醫藥函[2018]39號）;廣西中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑研究與開發項目（No.2018ZJ002）

*副主任中藥師，碩士。研究方向：中藥、民族藥防治肝病。電話：0771-5866681. E-mail： tacyxb@163.com