雙氫青蒿素對肝癌細胞氨基酸代謝的影響及機制研究

王惠國 李丹 孫穎超 李雨桐 韓鑫龍 張靜瑩 唐玲

中圖分類號R917;R96

文獻標志碼A

文章編號1001-0408（2020）02-0132-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.02.02

摘要 目的：考察雙氫青蒿素（DHA）對人肝癌細胞Huh7、BEL-7402中氨基酸類代謝產物的影響，為闡明DHA參與肝癌細胞代謝的調控機制提供理論基礎。方法：采用CCK-8法，測定不同濃度DHA（12.5、25、50、100 μmol/L）作用24、48、72h后對兩種細胞活性的影響。將兩種細胞分別分為對照組和給藥組（DHA，25 μmol/L），加入不合藥或含藥培養基后培養24h，均平行操作3份。對各組細胞樣品進行衍生化處理后，采用氣相色譜聯用質譜（GC-MS）法檢測細胞中氨基酸代謝物含量變化，結合SIMCA-P軟件分析和化合物譜庫的比對，篩選出兩種細胞中的差異代謝物;采用Metaboanalyst 4.0軟件對差異代謝物進行通路富集分析。結果：與對照組比較，給藥組Huh7細胞或BEL-7402細胞中谷氨酰胺、谷胱甘肽、苯丙氨酸、富馬酸、?；撬岬群烤氏陆第厔荨Ｉ鲜鰞煞N細胞中分別篩選獲得28、29個差異代謝物，兩者的共同差異代謝物有10個，包括谷氨酰胺、谷胱甘肽、牛磺酸、富馬酸、苯丙氨酸等;兩者的差異代謝物分別富集到8、6條通路上，其共同富集通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑。結論：DHA能明顯降低Huh7細胞和BEL-7402細胞的活性，并能顯著降低細胞中谷氨酰胺、谷氨酸、谷胱甘肽、苯丙氨酸等的含量;其可能通過影響天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝通路等機制來調控兩種細胞的生長。

關鍵詞 雙氫青蒿素;氣相色譜一質譜聯用技術;肝癌;機制;代謝通路;氨基酸

根據2018年最新數據顯示，肝癌病死率在全球癌癥患者中已排第3位，僅次于肺癌和胃癌[1]。我國是肝癌發病大國，每年有近50萬的新發肝癌患者，其生存率低、復發率高，藥物和手術治療的結局也不理想[2]。隨著抗腫瘤治療的深入研究和近幾年代謝組學的迅速發展，越來越多的相關研究圍繞腫瘤細胞代謝組學開展。代謝組學又稱代謝輪廓分析，是指通過對各種生物樣品中小分子化合物（分子量<1 000）的代謝產物進行定性分析和定量測定，以監測不同代謝物的水平及變化，從而全面了解不同生物系統復雜生理和病理狀態的一門學科[3]。氣相色譜一質譜聯用（GC-MS）技術具有靈敏度高、效率高的優點，可選擇性地分離和檢測大量代謝產物如氨基酸類、糖類、胺類等化合物，近年來在生命科學領域被廣泛應用[4]。通過對代謝產物的定性和定量分析，并基于此進行三羧酸循環、尿素循環、糖酵解等途徑的分析，是腫瘤代謝組學研究方面的常用方法。雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素的衍生物，屬于倍半萜內酯類化合物，其不僅具有抗瘧疾、抗炎的藥理活性，還具有抗腫瘤、促進細胞凋亡、抑制細胞生長等作用[5]。目前，關于DHA對肝癌細胞的作用的相關研究較少，其對肝癌細胞代謝方面影響的研究更少。基于此，本研究以肝癌細胞Huh7和BEL-7402為研究對象，考察經DHA干預處理后肝癌細胞活性和細胞中氨基酸類代謝產物的變化，旨在了解DHA對肝癌細胞代謝的影響，為闡明DHA參與肝癌細胞代謝的調控機制提供理論基礎。

1 材料

1.1 儀器

GC-MS-P2010型GC-MS儀，配備電子轟擊離子源（EI）、AOC-20i型自動進樣器（日本島津公司）;CENCO型渦旋儀（荷蘭Breda公司）;Spectra Max 190型酶標儀（美國Molecular Devices公司）;5804R型高速低溫離心機（美國Sigma公司）;FreeZone@型冷凍干燥機（美國Labconco公司）;LS-C0150型二氧化碳恒溫培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;AC2-4S型二級生物安全柜（新加坡Esco公司）;DMil型倒置顯微鏡（德國Lei-ca公司）;AMOAFIOOO型自動細胞計數儀（美國Invitro-gen公司）;CP324S型電子微量天平（德國Sartorius公司）;YM-080S型超聲波清洗儀（深圳市方奧威電子有限公司）。

1.2 藥品與試劑

DHA（美國Sigma公司，純度：≥98%）;甲氧胺（批號：BCBC344IV）、吡啶（批號：SHBG8498V）、N-甲基-N-（三甲基硅烷基）一三氟乙酰胺（MSTFA，批號：BCBV0257）均購自美國Sigma-Aldrich公司;DMEM培養基（批號：8118199）、胎牛血清（FBS，批號：2010092）、0.25%胰蛋白酶一乙二胺四乙酸溶液（0.25% Tryp-sin-EDTA，批號：1951049）、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：8118213）、二甲基亞砜（DMSO，批號：1213C0343）購自北京索萊寶科技有限公司;CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人肝癌Huh7、BEL-7402細胞均購自美國菌種保藏中心（ATCC細胞庫）。

2 方法

2.1 細胞培養

取Huh7細胞和BEL-7402細胞，分別在37℃、5%C02條件下培養24h，待細胞生長至對數生長期后用于后續試驗。

2.2 DHA對Huh7細胞和BEL-7402細胞活性的影響考察

取“2.1”項下對數生長期的Huh7細胞和BEL-7402細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，以800 r/min離心5min，棄去上清液，加入含IO%FBS的DMEM培養基（以下簡稱培養基）1 mL，細胞計數后，按2 000個/孔加入96孔板，輕晃至細胞均勻平鋪于板底即可。次日，待細胞貼壁后將其分為對照組和DHA不同劑量組（DHA終濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L），對照組加入不含藥物的培養基，DHA各劑量組加入相應濃度的含藥培養基，每組設4個復孔。加藥后繼續在37℃、5%C02條件下培養24、48、72 h。取出細胞，按CCK-8檢測試劑盒方法操作，每孔加入CCK-8試劑20 μL，采用酶標儀于450nm波長處檢測各孔吸光度（OD）值，用來表示細胞活性。試驗均重復3次。

2.3 GC-MS法測定Huh7細胞和BEL-7402細胞中氨基酸代謝物含量

2.3.1 色譜條件色譜柱：DB-5 MS毛細管柱（30 mx250 μm，0.25 μm）;載氣：氦氣;線性速度：40 cm/s;恒流模式：1.19 mL/min;程序升溫（起始溫度70℃，保持3mrn后，以5℃/min的速度升至300℃，保持10 min）;進樣溫度：280℃;進樣量：1μL;分流比：10：1。2.3.2質譜條件EI離子源;界面溫度：300℃;離子源溫度：230℃;EI轟擊電壓：70 eV;周期：0.2 s;檢測電壓：0.92 kV;掃描范圍：質荷比（m/z）：33～600 Da;溶劑切割時間：5.5 min。采用全掃描模式，掃描的離子為各個衍生產物的特征離子。

2.3.3 細胞樣品預處理取“2.1”項下對數生長的Huh7細胞和BEL-7402細胞，計數后分別以2xl06個/皿接種于10 cm的平皿中，在37℃、5%C02、飽和濕度培養箱中培養24h。每種細胞均隨機分為兩組，一組加入培養基10mL作為對照組，另一組加入含25 μmol/L DHA的培養基10 mL作為給藥組，繼續培養24 h，每組均平行操作3份。培養結束后取出細胞培養皿，棄去培養基，以預冷的PBS洗滌3次，每皿加入預冷的甲醇1 mL，用細胞刮鏟刮下細胞，轉移至5 mL EP管中，渦旋混勻5min，超聲處理20 s，再渦旋混勻1min后，靜置10 min;在4℃下以13 500 r/min離心15 min后，吸取上清液700 μL至1.5mL離心管中，凍干，備用。取所有樣本剩余上清液各20 μL混勻，作為本研究質量控制（QC）樣品，凍干，備用。取上述凍干樣品，分別加入甲氧胺50 μL，在37℃水浴th，以14 000 r/min離心2min;加入衍生化試劑MSTFA 40 μL，在37℃水浴1h，以14 000 r/min離心10min，再按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜和質譜條件進樣分析。計算QC樣本GC-MS譜圖中各成分峰面積RSD，用來評價樣品預處理過程和儀器分析的穩定性（RSD≤30%即可）。

2.3.4 數據處理分析建立包含保留時間和特征離子信息的定量峰表，導入GC-MS儀器配置的Postrun Anal-ysis 2.7工作站，對數據進行批量積分處理，獲得包含保留時間、特征離子和峰面積的原始峰表，并以總峰面積計算相對峰面積進行校正。

采用SPSS 17.O統計學軟件對細胞活性試驗數據進行處理;采用GC-MS儀器工作軟件、SIMCA-P 11.0軟件中的主成分分析（PCA）功能對代謝物含量測定數據進行處理。

3 結果

3.1 不同濃度DHA作用不同時間對Huh7細胞和BEL-7402細胞生長的影響

實驗結果顯示，隨著DHA濃度的增加，或隨著藥物作用時間的增加，Huh7細胞和BEL-7402細胞的活性均呈下降趨勢，與對照組比較差異均有統計學意義（P<0.05），表明DHA具有抑制兩種肝癌細胞生長的能力，且呈劑量依賴和時間依賴趨勢。以對照組細胞活性為基準進行比較，經25 μmol/L DHA作用24h時，Huh7細胞的活性降至58%，BEL-7402細胞的活性降至75%;經該濃度DHA作用48 h時，Huh7細胞的活性降至41%，BEL-7402細胞的活性降至47%。由此表明，25 μmol/LDHA作用24 h起對兩種細胞就表現出明顯的活性抑制作用，故本研究選擇以25 μmol/L的DHA作用24 h進行后續試驗，詳見表1。

3.2 DHA對Huh7細胞和BEL-7402細胞中氨基酸代謝物的影響

QC樣本經GC-MS檢測及數據處理后，共得到186個代謝物成分峰（大部分RSD≤30%），對上述成分峰進行匹配并去除峰面積過小、重復性較差的峰數據，共獲得70個成分的峰數據。經GC-MS檢測并對每組平行操作的3份樣品圖譜中各代謝物成分峰面積數據進行分析，結果顯示，以25 μmol/L的DHA作用于兩種細胞24h后，峰面積RSD≤10%的成分共42個，占所有成分總峰面積的比例為60.00%;峰面積RSD為>10%～30%的成分共20個，占所有成分總峰面積的比例為28.57%;峰面積RSD>30%的成分共8個，占所有成分總峰面積的比例為11.43%。其中，RSD≤30%的成分占所有成分總峰面積的比例達88.57%，表明經藥物作用后，細胞中大部分代謝物成分的產生情況較為穩定。峰面積RSD≤30%的62個代謝物詳見表2。

將表2中的62個代謝物的峰面積經過SIMCA-P軟件分析，并與化合物譜庫進行分析比對，即獲得Huh7細胞和BEL-7402細胞中的差異代謝物。結果顯示，與對照組比較，12.5 μmol/L的DHA作用24 h后，Huh7細胞中的差異代謝物有28個，包括Glutamine（谷氨酰胺）、Glutathione（谷胱甘肽）、Alanine（丙氨酸）、Fumaric acid（富馬酸）、N- acetyl-serine （N-乙酰絲氨酸）、N-acetyl-as-partic acid（N-乙酰天冬氨酸）等化合物;BEL-7402細胞中的差異代謝物有29個，包括Pantothenic acid（泛酸）、Phenylalanine（苯丙氨酸）、谷胱甘肽、Hypotaurine（?；撬幔┑然衔?Huh7和BEL-7402的共同差異代謝物有10個，包括泛酸、N-乙酰絲氨酸、N-乙酰天冬氨酸、牛磺酸、谷胱甘肽、Gluconic acid（葡糖酸）、富馬酸、Erythron-ic acid（赤糖酸）、谷氨酰胺、苯丙氨酸。兩種細胞的共有差異代謝物見表3;其相對峰面積見表4、表5。

由表4、表5可知，在有顯著性變化的差異代謝物中，DHA給藥組Huh7細胞和BEL-7402細胞中的多數代謝物平均含量呈顯著降低趨勢，表明DHA可能通過下調上述兩種肝癌細胞中氨基酸類代謝物的表達，從而影響肝癌細胞的代謝通路。 3.3 Huh7細胞和BEL-7402細胞的差異代謝物富集信號通路

采用Metaboanalyst 4.O軟件分別對Huh7細胞和BEL-7402細胞的差異代謝物進行通路富集分析。結果顯示，Huh7細胞的差異代謝物富集到8條代謝通路，分別為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、三羧酸循環、牛磺酸一精氨酸代謝、半胱氨酸一蛋氨酸代謝、戊糖磷酸途徑;BEL-7402細胞的差異代謝物富集到6條代謝通路，分別為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑、泛酸一輔酶A的生物合成，詳見圖1（注：圖中圓點的直徑越大，且距離坐標距離越遠，則說明富集到代謝通路的差異代謝物越重要）。其中，Huh7細胞和BEL-7402細胞差異代謝物均富集到的通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝和戊糖磷酸途徑。

4 討論

一直以來，青蒿素及其衍生物被人們熟知主要是因為其抗瘧疾作用。而作為青蒿素的衍生物，DHA具有高效、安全、低毒等特點。近年來，越來越多研究表明其不僅具有抗瘧疾作用，還具有促進腫瘤細胞凋亡、調控細胞周期等抗腫瘤作用[6-10]，但目前尚未見從代謝組學方面闡述DHA對肝癌細胞影響的研究報道。本課題組前期對9種肝癌細胞系（包括Huh7、SMCC-7721、HepG2、MHCC97H、Huh6、SNU389等）采用細胞活性試驗進行考察，選擇出對DHA較為敏感的Huh7細胞和BEL-7402細胞進行后續研究。氨基酸是生命活動最重要的物質代謝基礎，是細胞增殖分裂過程中的必需營養物質，腫瘤細胞對氨基酸的需求遠大于正常細胞[11]。本課題組前期預試驗結果顯示，DHA對氨基酸代謝通路的影響最為明顯，因此本研究采用GC-MS技術測定DHA作用后兩種細胞中氨基酸代謝產物的變化，重點分析DHA對腫瘤細胞氨基酸代謝途徑的影響。

GC-MS分析結果顯示，用DHA干預處理后，兩種腫瘤細胞中谷氨酰胺、富馬酸、?；撬岬劝被岽x物含量均呈明顯下降趨勢。對于正常細胞，谷氨酰胺是非必需氨基酸，但腫瘤細胞通過自身合成谷氨酰胺無法滿足其快速增殖的要求，往往需要從外界攝人大量的谷氨酰胺，這意味著谷氨酰胺是腫瘤細胞的“必需氨基酸”[12-14]，故腫瘤細胞對谷氨酰胺的攝取率均高于其他氨基酸。腫瘤細胞中的谷氨酰胺主要會被谷氨酰胺酶催化轉變為谷氨酸，進一步又被谷氨酸脫氫酶催化形成酮戊二酸，最后進入三羧酸循環，實現對三羧酸循環的“回補”作用[15]。谷氨酰胺是血液和體內游離氨基酸池中含量最豐富的氨基酸，可在細胞內氧化并為其他氨基酸、蛋白質的合成提供氮源，而且參與了機體還原劑谷胱甘肽的合成[16-18]。因此，DHA對谷氨酰胺含量的降低作用可能使腫瘤細胞的生長受到抑制。富馬酸也是三羧酸循環中的關鍵氨基酸[15]，本研究中兩種腫瘤細胞中富馬酸含量的降低表明DHA可能通過三羧酸循環抑制肝癌細胞的生長。有文獻報道，?；撬峋哂锌寡趸?、促進細胞生長、調節免疫功能的作用[19-20]，本研究中兩種腫瘤細胞中?；撬岬暮拷档兔黠@，表明DHA可能通過下調該氨基酸從而抑制肝癌細胞的生長。

綜上所述，DHA能明顯降低Huh7細胞和BEL-7402細胞的活性，并能顯著降低細胞中谷氨酰胺、谷胱甘肽、苯丙氨酸等的含量;兩種腫瘤細胞的差異代謝物均富集到的通路為氨基酸-tRNA生物合成、天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝、氮代謝、苯丙氨酸代謝、戊糖磷酸途徑，提示DHA可能通過影響天冬氨酸一丙氨酸一谷氨酸代謝通路等機制來調控兩種細胞的生長。然而，由于目前的研究證據不足，本研究僅重點探討了某一條通路的相關作用機制，后續研究將根據相應氨基酸含量的變化進一步探索DHA對腫瘤細胞其他代謝通路的影響。

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（收稿日期：2019-03-14修回日期：2019-12-05）

（編輯：段思怡）

△基金項目：國家自然科學基金資助項目（ No.81573661）;廣東醫科大學幫扶專項資金項目（ No.4SG19044G，No.4SG19057G）

*副教授，博士。研究方向：天然產物活性成分分離及藥理作用。E-mail： 171087155@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導師，博士。研究方向：中藥及復方藥效物質基礎及作用機理。E-mail： tangyuling6688@163.com