α-烯醇化酶在肝癌中的表達及其聯合甲胎蛋白在肝癌診斷中的應用價值

殷淑君 張 坤 蔣知新

(1 北京回龍觀醫院檢驗科，北京市 100096，電子郵箱：Yinshujunots@163.com；中國人民解放軍第三〇五醫院2 泌尿外科，3 中心實驗室，北京市 100017)

肝癌是發病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一。原發性肝癌按照病理類型可分為3種，其中90%為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，因早期癥狀不明顯，多數HCC患者發現時已經為中晚期[1]。目前，肝癌診斷主要依賴于影像學檢查和組織活檢，在腫瘤早期篩查及診斷方面仍存在困擾[2]。隨著對腫瘤標志物的了解加深與重視，腫瘤相關蛋白標志物已成為重要的輔助診斷、判斷預后和指導治療的生物學指標[1]。甲胎蛋白為臨床常規使用的肝癌相關血清學標志物，而妊娠、生殖腺胚胎癌和普通活動性肝病等患者也會出現甲胎蛋白的持續升高，且部分HCC患者，尤其是高分化和低分化或已壞死液化HCC患者的甲胎蛋白水平并不升高，因此亟須尋找新的更可靠的標志物。α-烯醇化酶(alpha-enolase,ENO1)作為糖代謝過程中的關鍵酶，在細胞能量代謝過程中發揮重要作用[3]。近年有大量研究證實了其表達量的變化與多種疾病之間密切相關[4-5]。也有研究證實，相對于正常癌旁組織，肝癌組織中的ENO1呈高表達，且ENO1的高表達可促進肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲[6-7]。以上提示ENO1可能為潛在的肝癌相關血清學指標，但目前關于ENO1在肝癌患者外周血中的表達研究極少。本研究旨在探究HCC患者外周血血清中ENO1蛋白水平在肝癌診斷中的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年10月至2019年8月解放軍總醫院第七醫學中心及中國人民解放軍第305醫院肝病科、肝膽外科、腫瘤科收治的所有HCC、肝硬化患者作為研究對象，其中90例HCC患者作為HCC組，45例肝硬化患者作為肝硬化組。均由經驗豐富的臨床醫生嚴格按照相關指南[8-9]做出診斷。納入標準：經實驗室檢查、影像學檢查、病理學檢查最終診斷為HCC或肝硬化且未接受過放療、化療及手術治療的患者。排除標準：合并其他癌癥患者；接受過手術、放化療及其他抗腫瘤治療者；其他原因導致的嚴重肝損害者或其他嚴重疾病；存在認知障礙和語言障礙、無法進行良好溝通者；臨床資料不完善，不符合本研究需求者。另選取同期于上述醫院體檢中心進行健康查體者45例作為健康對照組。納入標準：各項腫瘤標志物值均正常，影像學檢查未發現結節、占位等。排除標準：腫瘤標志物檢測存在異常，影像學檢查發現結節、占位者；合并其他嚴重疾病者。HCC組年齡(58.58±9.59)歲，男性73例；肝硬化組年齡(60.58±11.28)歲，男性35例；健康對照組年齡(61.96±7.87)歲，男性36例。3組患者的年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過中國人民解放軍第305醫院醫學倫理部門審查，所有調查對象在調查取樣前均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本的采集與保存：治療前，所有研究對象均空腹12 h以上，于次日清晨采集空腹靜脈血4 mL，采血后30 min內以3 000 r/min離心10 min，分離上層血清，記錄患者信息及標本收集時間后將血清儲存于-80 ℃冰箱待檢。

1.2.2 ENO1的檢測：采用ELISA法檢測血清中的ENO1水平，人ENO1 酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒(生產批號：ab181417)購自英國Abcam公司。(1)取出實驗所需要的所有試劑，在室溫下平衡30 min，按照說明書配制實驗試劑。(2)配制ENO1標準蛋白溶液并進行梯度倍比稀釋，稀釋后濃度依次為800 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、0 ng/mL。(3)在96孔反應板中依次加入50 μL標準品或樣本、50 uL抗體混合液，將反應板密封，室溫下置于搖板機上孵育1 h，棄去孔中液體，每孔加入350 μL清洗液，清洗3次。最后一次清洗后，將反應板翻轉過來，用干凈的紙巾吸干多余的液體。隨后，每孔加入100 μL 四甲基聯苯胺反應底物，室溫下避光放置于搖床上10 min。(4)每孔加入100 μL反應終止液，混勻1 min，采用Multiskan FC全自動酶標比色儀(美國賽默飛世爾科技公司)于450 nm處讀取吸光度值。

1.2.3 甲胎蛋白的檢測：采用電化學發光免疫分析系統(Cobas e601，羅氏集團)檢測血清樣本中的甲胎蛋白水平，試劑盒(生產批號：04491743)購自德國羅氏診斷有限公司。

1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。所有數據均進行正態性檢驗以確定資料是否符合正態分布，不符合正態分布的計量資料以中位數和四分位數[M(P25,P75)]表示，多組間比較采用非參數Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用拓展t檢驗。雙變量之間的相關性采用Spearman相關分析。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析各指標的診斷價值。ENO1或甲胎蛋白水平大于其單獨診斷HCC的最佳截斷值即判斷為聯合診斷陽性，反之則為陰性。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組血清ENO1水平和甲胎蛋白水平的比較及其相關性 3組患者的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，且健康對照組、肝硬化組、HCC組的血清ENO1水平、甲胎蛋白水平均依次升高(均P<0.05)，見表1。雙變量Spearman相關性分析結果顯示，3組患者的ENO1水平與甲胎蛋白水平呈正相關(rs=0.393，P=0.002)。

表1 3組患者血清ENO1蛋白水平、 甲胎蛋白水平比較[M(P25,P75),ng/mL]

2.2 3組ENO1、甲胎蛋白水平及二者聯合檢測診斷HCC的ROC曲線分析 結果顯示，ENO1、甲胎蛋白水平及二者聯合檢測診斷HCC的ROC曲線下面積分別為0.817(95%CI：0.755～0.879)、0.821(95%CI：0.756～0.886)、0.862(95%CI：0.809～0.914)(均P<0.05)，聯合診斷的曲線下面積均大于ENO1、甲胎蛋白水平單獨診斷(均P<0.05)。見表2、圖3。

表2 ENO1、甲胎蛋白及二者聯合檢測 診斷HCC的效能

圖3 ENO1聯合甲胎蛋白診斷HCC的ROC曲線

3 討 論

原發性肝癌是全球第五大常見腫瘤，其中90%為發病率和病死率均較高的HCC，有效的腫瘤標志物可以輔助診斷、判斷預后和指導治療。目前用于輔助診斷HCC的標志物主要為甲胎蛋白，但甲胎蛋白在診斷準確率方面存在一定限制[10]。因此，廣大研究者正在尋找新的可以輔助肝癌診斷的標志物，并將多個標志物聯合起來建立模型來提高診斷效能。本研究探討了ENO1作為肝癌診斷血清標志物的潛在可能性，并評估了ENO1聯合甲胎蛋白診斷肝癌的臨床應用價值。

ENO1作為糖代謝過程中的關鍵酶，主要位于細胞質，可能通過腫瘤細胞損傷、壞死或者其他途徑被釋放到細胞外，從而進入外周血[11]。目前已有研究證實，相對于正常癌旁組織，肝癌組織中的ENO1呈高表達，且ENO1的高表達可促進肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲[6]。據此，我們推測HCC患者可能存在血清ENO1濃度升高的情況。本研究結果顯示，相比于健康人群和肝硬化患者，HCC患者血清中的ENO1、甲胎蛋白水平明顯升高(P<0.05)，這提示ENO1或可成為新的肝癌相關血清學標志物。預后分析發現，ENO1 mRNA高表達者的全因生存時間及無進展生存時間均短于ENO1 mRNA低表達者[7]，這提示肝癌組織中ENO1的表達情況與患者的病情進展、預后均存在關聯。本研究中肝硬化組的ENO1、甲胎蛋白水平高于健康體檢組(P<0.05)，提示ENO1在肝硬化期已開始輕度升高，但因本研究納入的肝硬化、HCC患者均為肝炎患者，結合肝炎、肝硬化、肝癌的經典臨床進展過程分析，我們認為通過檢測血清ENO1水平的變化或可早期預測肝炎肝硬化患者的進展，這為肝癌的早期篩查提供新的思路和依據，但這還需要根據患者的情況進行細分，并需通過進一步實驗去驗證。

本研究結果顯示，ENO1、甲胎蛋白對HCC具有較高的診斷效能，但ENO1聯合甲胎蛋白診斷HCC的曲線下面積高達0.862，高于任一指標單獨檢測(均P<0.05)，這提示二者聯合檢測可有效輔助臨床診斷HCC。二者聯合檢測雖然提高了敏感度(93.3%)，但該方法的特異度較低，因此聯合檢測更適合用于HCC的篩查。

綜上所述，ENO1或可成為新的肝癌相關血液學標志物，其診斷HCC具有一定的臨床應用價值。聯合使用甲胎蛋白和ENO1可獲得比單個標志物更強的輔助診斷效能，因此ENO1可作為甲胎蛋白診斷HCC的互補指標，推薦兩者聯合使用以提高診斷的準確性。