血清微小RNA-424聯合血清人胎球蛋白A抗體、精子相關抗原9抗體診斷乳腺癌的價值▲

李宗龍 李 英 白文輝 馬志娟 沈國雙

(青海紅十字醫院1 乳腺外科，2 手術室，西寧市 810000，電子郵箱：lizonglong2893@163.com；3 青海大學附屬醫院乳腺甲狀腺外科，西寧市 810000)

乳腺癌發病率占女性腫瘤首位，且近年來呈上升趨勢，嚴重威脅女性身心健康[1]。由于乳腺癌早期臨床癥狀不明顯，大多數患者確診時已錯過最佳治療時期，嚴重影響患者的生存質量。因此，早診斷、早治療是提高乳腺癌患者生存質量的有效手段。微小RNA(microRNA，miRNA)-424參與細胞增殖、轉移及凋亡等過程，其異常表達與乳腺癌的發展進程有關[2]。人胎球蛋白A又稱α2-HS糖蛋白(alpha-2-Heremans-Schmid glycoprotein，AHSG)，其抗體具有多種生物學功能，對乳腺癌患者的早期診斷及預后評估有指導意義[3-4]。精子相關抗原9(sperm-associated antigen 9，SPAG9)抗體與多種腫瘤的生長、侵襲及遷移有關，在乳腺癌患者中SPAG9抗體水平升高可作為乳腺癌患者早期診斷和療效評價的重要指標之一[5]。血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體單獨診斷乳腺癌的準確度較低，容易出現漏診、誤診，因此，本研究分析血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯合檢測對乳腺癌的診斷價值，以期為早期診斷乳腺癌提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2016年10月至2018年10月青海紅十字醫院乳腺外科收治的58例乳腺癌患者作為研究對象(乳腺癌組)，同時選取同時期該醫院收治的55例乳腺纖維腺瘤患者為良性疾病組，兩組患者均經病理確診[6]；另選取同時期在該醫院體檢的51例健康女性為健康對照組。3組研究對象的納入標準：(1)臨床資料或體檢資料完整；(2)采集靜脈血前未接受任何手術治療。排除標準：(1)既往有其他惡性腫瘤病史者；(2)既往有免疫系統疾病病史者；(3)近3個月有重大外傷或感染病史者；(4)肝、腎功能異常者。乳腺癌組年齡31～77(50.68±13.64)歲；浸潤性導管癌42例，導管內癌11例，乳腺黏液癌5例；臨床分期Ⅰ期17例，Ⅱ期29例，Ⅲ期12例。良性疾病組年齡30～77(49.85±12.20)歲，健康對照組年齡30～76(49.97±12.51)歲。3組研究對象的年齡差異無統計學意義(P>0.05)，具體可比性。本研究經青海紅十字醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象或其家屬均對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與保存：乳腺癌組和良性疾病組患者均于住院第二天清晨采集空腹靜脈血5 mL，健康對照組女性于體檢當天清晨采集空腹靜脈血5 mL，均在10℃～15℃下3 000 r/min離心5～10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱，在12 h內檢測血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平。

1.2.2 血清miRNA-424相對表達量檢測：采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測3組受試者的血清miRNA-424相對表達水平，qRT-PCR儀購自瑞士羅氏公司(型號：LightCycler 96)。采用TRIzol Reagent試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司，批號：20150212)提取血清總RNA，反轉錄(37℃，60 min；85℃，5 s)得cDNA。以U6作為內參擴增miRNA-424，引物序列見表1。qRT-PCR反應體系共20 μL：cDNA(50 ng/μL)2 μL，miScript SYBR? Green Mix 10 μL，上下游引物(10 μM)各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s；60℃ 15 s；70℃ 20 s；共40個循環。qRT-PCR反應均設置3個復孔，反應結束后，取平均值，采用2-ΔΔCt法計算血清miRNA-424相對表達水平。

表1 引物序列

1.2.3 血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平檢測：采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平。人AHSG抗體、人SPAG9抗體標準品均由北京雅安達生物技術有限公司提供(批號：20150612)，具體操作參照說明書進行。取出實驗所需板條，空白孔加入標準品和標本稀釋液，其余孔加入不同濃度標準品(100 μL/孔)，用封板膠紙封住反應孔，36℃孵育箱孵育90 min；洗板5次；空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100 μL/孔)，用新封板膠紙封住反應孔，36℃孵育箱避光孵育30 min；洗板5次，加入顯色底物(四甲基聯苯胺)100 μL/孔， 36℃避光孵育15 min。加入終止液100 μL/孔混勻后，終止反應，然后以空白孔為標準進行調零，3 min內依序測量各孔在450 nm波長下的吸光度(OD)值，根據所得的標準曲線和OD值計算每個標記物在血清中的相應濃度。

1.2.4 乳腺癌診斷標準：本研究采用串聯試驗，單獨診斷時采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC) 曲線的最佳截斷值為診斷界值，大于AHSG抗體、SPAG9抗體截斷值或小于miRNA-424截斷值時診斷為乳腺癌，聯合診斷時需同時滿足單獨診斷的條件方能診斷為乳腺癌。

1.3 統計學分析 采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以頻數和百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用ROC曲線分析各指標單獨及聯合診斷乳腺癌的效能。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組血清miRNA-424相對表達水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平比較 健康對照組、良性疾病組、乳腺癌組血清miRNA-424相對表達水平依次降低，血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)。見表2。

表2 三組血清miRNA-424相對表達水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平比較(x±s)

2.2 乳腺癌患者血清miRNA-424相對表達水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平與臨床分期的關系 乳腺癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清miRNA-424相對表達水平依次降低，血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)。見表3。

表3 血清miRNA-424相對表達水平、AHSG抗體及SPAG9抗體水平與乳腺癌臨床分期關系(x±s)

2.3 各指標單獨及聯合檢測診斷乳腺癌的ROC曲線分析 以乳腺癌組和良性疾病組患者為研究對象，分析血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平單獨檢測及聯合檢測診斷乳腺癌的效能。結果顯示，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體、miRNA-424聯合AHSG抗體、miRNA-424聯合SPAG9抗體診斷乳腺癌的曲線下面積分別為0.796、0.846、0.866、0.902、0.868，三者聯合檢測診斷乳腺癌的曲線下面積為0.927。三者聯合檢測的曲線下面積高于miRNA-424水平單獨檢測(P<0.05)，而三者聯合檢測的曲線下面積與其他各項指標單獨檢測比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表4、圖1。

表4 各指標單獨及聯合檢測診斷乳腺癌的ROC曲線分析結果

圖1 各指標單獨及聯合檢測對乳腺癌診斷價值的ROC曲線

2.4 各指標單獨及聯合檢測診斷乳腺癌的效能 各組檢測方法的準確度及陰性預測值比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯合檢測診斷乳腺癌的準確度高于AHSG抗體單獨檢測(P<0.05)，而各組陰性預測值的兩兩比較差異均無統計學意義(均P>0.05)；各檢測方法的靈敏度、特異度和陽性預測值差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表5。

表5 血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體水平單獨及聯合檢測診斷乳腺癌的效能[%(n/N)]

3 討 論

乳腺癌發生于乳腺上皮組織，主要臨床表現有乳腺腫塊、乳頭溢液及腋窩淋巴結腫大等，且發病年齡趨于年輕化，大多數乳腺癌患者確診時已處于中晚期，治療預后較差[7]。因此，探索新的腫瘤標志物，對于在乳腺癌發展早期發現疾病并盡早采取有效治療手段，降低死亡率具有重要意義。由于臨床常規檢查不能滿足早期診斷乳腺癌的需求，易延誤病情，而血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體在檢測乳腺癌上具有良好的臨床應用前景。因此，本研究比較上述3個指標單獨及聯合檢測對乳腺癌的診斷效能，以期為乳腺癌的早期診斷和臨床治療提供新方向。

miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，在真核生物中廣泛存在，參與細胞生長、發育等過程，與多種疾病的發生、發展有關[8]。miRNA具有高度保守性，通過與靶標基因3′端非翻譯區配對，能調控細胞增殖、凋亡等多種生物學功能。miRNA-424位于人染色體Xp26.3，在宮頸癌患者中表達失調，并與腫瘤侵襲、轉移密切相關[9]。欒磊等[10]發現，宮頸組織中miRNA-424水平與宮頸癌病變嚴重程度有關，宮頸病變越嚴重，miRNA-424水平越低。本研究結果顯示，乳腺癌患者血清miRNA-424相對表達水平最低、乳腺良性疾病患者次之、健康對照組最高(P<0.05)；且乳腺癌Ⅲ期患者血清miRNA-424相對表達水平最低、Ⅱ期次之、Ⅰ期最高(P<0.05)，與上述研究結果相似，表明血清miRNA-424表達下調可能與乳腺癌的發生、發展有關，其或可作為早期篩查和診斷乳腺癌的血清學腫瘤標記物。但ROC曲線分析結果顯示，血清miRNA-424診斷乳腺癌的曲線下面積較小，且特異度和靈敏度也較低，因此其單獨檢測診斷乳腺癌的價值不高，應與其他指標聯合診斷乳腺癌。

AHSG是由肝臟細胞分泌合成的糖蛋白，位于人3號染色體，包含6個內含子和7個外顯子，具有調節鈣化、胰島素抵抗及負性應激等生物學功能[11]。AHSG為腫瘤相關抗原，其抗體可作為腫瘤篩查的血清標記物。SPAG9位于人染色體17p21.33，通過與c-Jun氨基端激酶結合，參與調節多種生理功能[12]。研究顯示，SPAG9在人體多種腫瘤中均有表達，且可誘發機體內的自身免疫反應產生SPAG9抗體，而SPAG9抗體表達異常與前列腺癌、肺癌等多種腫瘤的發生、發展有關，在腫瘤早期診斷及靶向治療方面具有一定作用[13-14]。李琳[15]發現，妊娠期糖尿病患者血清AHSG水平明顯高于健康孕婦，與糖脂代謝紊亂關系密切。Nimptsch等[16]的研究顯示，大腸癌患者血清AHSG表達上調，其表達異常與大腸癌發展進程有關。毛立軍等[17]發現，前列腺癌組織中的SPAG9蛋白陽性率明顯高于前列腺增生組織，表明SPAG9參與前列腺癌的發生和轉移。還有學者發現，乳腺癌組織中SPAG9蛋白的異常表達與病變大小、淋巴結轉移及術后復發有關，提示SPAG9表達上調是乳腺癌患者預后不良的獨立危險因素[18]。本研究中，乳腺癌患者血清AHSG抗體和SPAG9抗體水平最高、乳腺良性疾病患者次之、健康女性最低，且乳腺癌臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清AHSG抗體和SPAG9抗體水平依次升高(均P<0.05)，與上述研究結果相似[14-17]，表明血清AHSG抗體、SPAG9抗體水平可反映乳腺癌病情變化，或可作為診斷和治療乳腺癌的新靶點。本研究ROC曲線分析結果顯示，血清AHSG抗體、SPAG9抗體單獨診斷乳腺癌的靈敏度高，但特異度均較低，提示血清AHSG抗體、SPAG9抗體單獨診斷乳腺癌容易出現誤診現象，延誤患者病情。進一步研究發現，血清miRNA-424、AHSG抗體、SPAG9抗體三者聯合檢測診斷乳腺癌的ROC曲線下面積較大，且準確度高于AHSG抗體單獨檢測，但三者聯合檢測的曲線下面積僅高于血清miRNA-424單項檢測時的曲線下面積(P<0.05)，而與其他各項指標檢測的曲線下面積差異無統計學意義(均P>0.05)。這提示單獨檢測一個或兩個指標診斷乳腺癌有一定的局限性，而三者聯合檢測雖然能提高乳腺癌的診斷效能，但是提高幅度不大，分析其原因可能是由本研究納入的樣本量較少造成的，因此今后還有待進一步擴大樣本量來分析三者聯合檢測是否適用于乳腺癌的臨床診斷，并篩選出具有較高靈敏度和特異度的指標，以達到節省醫療成本，提高診斷效能的目的。

綜上所述，乳腺癌患者血清miRNA-424相對表達水平降低、AHSG抗體和SPAG9抗體水平升高，三者聯合檢測診斷早期乳腺癌的效能較高，今后還需加強對乳腺癌臨床篩查指標的研究。