甲狀腺腫瘤患者PCDH8基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及其臨床意義▲

朱明章 梁偉新 賴勇強(qiáng) 彭和平 黃尚書(shū) 馮偉兆 谷小玉 李林株 李志宏

(廣東省佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院1 普外科，3 病理科，佛山市 528500,電子郵箱：358767716@qq.com；2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科，廣東省廣州市 510260)

甲狀腺癌是頭頸部和內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類型，發(fā)病率高，生長(zhǎng)緩慢，預(yù)后較好，但易發(fā)生早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后復(fù)發(fā)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，多種基因DNA甲基化與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-8]。原鈣黏蛋白8(protocadherin 8，PCDH8)是鈣黏附蛋白家族中的一員，在細(xì)胞黏附、增殖、分化和遷移中起著重要的作用[9]。已有研究證實(shí)PCDH8基因?yàn)橐粋€(gè)候選的抑癌基因，其通過(guò)突變或啟動(dòng)子甲基化在多種癌癥中失活，包括乳腺癌、袖套淋巴細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、鼻咽癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等[10-19]。但目前關(guān)于PCDH8基因甲基化與甲狀腺腫瘤關(guān)系的研究仍鮮有報(bào)道。本研究檢測(cè)甲狀腺腫瘤和正常組織中PCDH8基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)水平，探討PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與PTC臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2013年6月至2016年12月期間在佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除甲狀腺組織的180例患者作為研究對(duì)象，其中PTC48例、甲狀腺濾泡狀腺瘤43例、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫44例和正常甲狀腺組織45例，所有患者均經(jīng)病理檢查確診，患者術(shù)前均未行放化療。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)PTC、甲狀腺腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫均符合2012年《中國(guó)甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》；(2)年齡18～65歲；(3)入組前未接受放化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他惡性腫瘤病史或合并其他惡性腫瘤者；(2)合并其他嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者。本研究已通過(guò)佛山市高明區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查，且獲得所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 試劑及引物 DNA提取試劑盒購(gòu)自上海基因科技公司(批號(hào)：2018111401)，亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(批號(hào)：20170531)，焦磷酸測(cè)序試劑盒(PyroMark Gold Q96 Reagents)購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(批號(hào)：154037384)，免疫組化一抗人抗鼠PCDH8抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司(批號(hào)：L-20170113)，二抗羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自美國(guó)BIOWORLD公司(批號(hào)：BS12471)，甲基化基因測(cè)序試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司(批號(hào)：157025148)，DAB顯色液購(gòu)自杭州協(xié)博醫(yī)藥公司(批號(hào)：20024970)；所有引物設(shè)計(jì)均采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，由上海英濰捷基公司合成并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)標(biāo)本DNA甲基化 按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取標(biāo)本DNA，使用亞硫酸氫鹽修飾及純化試劑盒對(duì)提取好的組織DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾及純化，于-20℃保存?zhèn)溆谩；騊CR擴(kuò)增，亞硫酸輕鹽處理后測(cè)序，上游引物：5′-ATTAAAGGGATTGTTAGAGGTAGG-3′， 下游引物：5′-CTCATACCTCCAACCTCAAATAC-3′(5′端生物素標(biāo)記)。按照下列反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 25 s，48℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)目的條帶。甲基化基因測(cè)序：制備含生物素標(biāo)記DNA單鏈，按照PyroMark ID遺傳分析系統(tǒng)和試劑盒說(shuō)明書(shū)，用序列分析和單核苷酸多態(tài)性模式進(jìn)行測(cè)序位點(diǎn)分析。檢測(cè)位點(diǎn)：PCDH8基因啟動(dòng)子，NCBI Reference Sequence：NC_000013.11(chromosome 13,GRCh38.p7，52848593-52848604)。檢測(cè)序列：CGGGTCCGCGCG。4個(gè)位點(diǎn)任意一個(gè)出現(xiàn)C，且測(cè)序比例大于20%，則表示發(fā)生甲基化；相反，4個(gè)位點(diǎn)C的測(cè)序比例均小于20%，則表示未甲基化。

1.4 免疫組化法檢測(cè)PCDH8蛋白表達(dá) 對(duì)石蠟包埋的甲狀腺標(biāo)本進(jìn)行厚度為5 μm的連續(xù)切片，標(biāo)記、分類及晾干后放入60℃烤箱中烤片1 h。脫蠟后用pH=7.3的10 mM磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，5 min/次；使用3% H2O2浸泡標(biāo)本15 min，微波爐低火阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶5 min，再使用10 mmol/L檸檬酸鈉浸泡，高溫高壓(100℃～120℃，80～90 kPa)進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后采用PBS緩沖液沖洗3次，5 min/次，加入PCDH8一抗(1 ∶100)4℃孵育過(guò)夜。次日，采用PBS緩沖液沖洗切片3次，5 min/次，滴入二抗IgG(1 ∶200)，37℃孵育40 min，PBS緩沖液再?zèng)_洗3次，5min/次，滴加DAB顯色液顯色3～5 min。水洗終止顯色，蘇木素染細(xì)胞核15 s，水洗、藍(lán)化、脫水、透明、封片。奧林巴斯CX31顯微鏡下觀察并照相。根據(jù)細(xì)胞顯色深淺記分，無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分， 0～2分判斷為PCDH8表達(dá)陰性，≥3分判斷為PCDH8表達(dá)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；焦磷酸測(cè)序甲基化率和免疫組化基因表達(dá)調(diào)控率比較采用McNemar檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組甲狀腺標(biāo)本PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)情況的比較 4組甲狀腺組織的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化焦磷酸測(cè)序及蛋白表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其中PTC的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化率高于正常甲狀腺組織，PCDH8基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05)，而其他3組的上述指標(biāo)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組甲狀腺組織PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化及蛋白表達(dá)情況的比較[n(%)]

2.2 PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化和蛋白表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性 正常甲狀腺組織PCDH8蛋白表達(dá)陽(yáng)性的24例標(biāo)本中，PCDH8基因未發(fā)生甲基化為20例，重合率為83.33%。甲狀腺癌標(biāo)本PCDH8蛋白表達(dá)陰性的37例標(biāo)本中，有33例發(fā)生PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化，重合率為89.18%。對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果進(jìn)行McNemar檢驗(yàn)，焦磷酸測(cè)序和免疫組化檢測(cè)結(jié)果一致并無(wú)明顯差異(P=1.000)，說(shuō)明基因啟動(dòng)子甲基化和蛋白表達(dá)陰性存在一定相關(guān)性。

2.3 PTC患者PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與其臨床病理特征的相關(guān)性 PTC患者PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)性(P<0.05)，而與其年齡、性別、術(shù)前促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無(wú)明顯關(guān)系(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PTC患者PCDH8基因啟動(dòng) 子甲基化與其臨床病理特征的相關(guān)性(n)

3 討 論

抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要分子生物學(xué)事件。有研究證實(shí)，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制都可能導(dǎo)致抑癌基因失活[20-22]。研究表明，抑癌基因的高甲基化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的特征之一，并可作為診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[20-21]。因此，抑癌基因的高甲基化水平在腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估和基因靶向治療方面具有廣大前景。鈣黏蛋白被認(rèn)為在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起構(gòu)建和維持組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵作用[22-25]。鈣黏蛋白家族分為經(jīng)典鈣黏蛋白、橋粒鈣黏蛋白和原鈣黏蛋白。原鈣黏蛋白是鈣黏附蛋白超家族中最大的亞群，鈣黏附家族基因的異常啟動(dòng)子甲基化被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[10,26-28]。PCDH8是原鈣黏蛋白家族成員之一，已有研究發(fā)現(xiàn)其在不同的腫瘤基因中發(fā)生異常甲基化，導(dǎo)致PCDH8基因發(fā)生突變或表觀遺傳性沉默，而外源性表達(dá)PCDH8基因可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，具有抑癌基因的作用[10-19]。

本研究觀察甲狀腺腫瘤中PCDH8基因DNA啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及基因蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PTC的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化率高于正常甲狀腺組織，PCDH8基因蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于正常甲狀腺組織(均P<0.05)，而甲狀腺濾泡狀腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化率和蛋白表達(dá)陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且PTC的PCDH8蛋白表達(dá)陰性率高達(dá)77.08%，PCDH8基因甲基化率高達(dá)81.25%，這表明與正常甲狀腺組織相比，PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化在PTC中更為常見(jiàn)。結(jié)合PCDH8基因的甲基化狀態(tài)和蛋白表達(dá)情況，本研究分析發(fā)現(xiàn)PCDH8基因發(fā)生甲基化與基因蛋白表達(dá)缺失在PTC的重合率為89.18%，這表明PCDH8基因甲基化與蛋白表達(dá)調(diào)控具有一定的關(guān)聯(lián)性，與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道[10,15,17,19]的結(jié)果相符合。此外，有研究發(fā)現(xiàn)PCDH8基因甲基化與腫瘤患者的甲胎蛋白水平、預(yù)后、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、組織形態(tài)、臨床分期和病理分級(jí)等具有相關(guān)性[17-19]。本研究結(jié)果顯示，PTC患者的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與其年齡、性別、促甲狀腺激素水平、抗甲狀腺球蛋白抗體水平及腫瘤部位無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。這可能與抑癌基因的甲基化失活，其內(nèi)在黏附、遷移、增殖功能改變，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)。

綜上所述，PTC患者中的PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化率高，PCDH8蛋白表達(dá)水平低，PCDH8基因甲基化與蛋白表達(dá)調(diào)控具有一定的關(guān)聯(lián)性，且PCDH8基因啟動(dòng)子甲基化與PTC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，或可作為甲狀腺腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。