結(jié)直腸癌患者血漿微小RNA-200a的表達水平及臨床意義▲

潘志剛 蘇東星 梁梓宇 黃曉玲 鄭 捷

(廣西南寧市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧市 530031，電子郵箱：panzhigang00@126.com)

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，隨著我國人民生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，該病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。目前臨床上常用的結(jié)直腸癌血液診斷指標為癌胚抗原和糖類抗原199，但這兩個指標的假陽性率均較高[2]。研究表明，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中多個微小RNA(microRNA，miRNA)的表達水平發(fā)生顯著改變，有可能作為診斷腫瘤的有效指標[3]。miRNA-200a是miRNA-200家族重要成員之一，在一些腫瘤中呈高表達[4]。研究顯示，miRNA-200a在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達水平均高于正常組織，提示miRNA-200a與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。然而，目前國內(nèi)關(guān)于血漿miRNA-200a表達水平與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系的研究仍較少。因此，本研究檢測結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a表達水平，探討其對結(jié)直腸癌的診斷價值，并分析其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年6月在我院診治的52例結(jié)直腸癌患者作為研究對象。納入標準：所有患者均經(jīng)腸鏡活檢確診為結(jié)直腸癌，臨床資料完整。排除標準：合并有嚴重心、肝、腎疾病的患者；合并有風濕性關(guān)節(jié)炎等免疫性疾病患者。另選取同期52例健康的體檢者為健康對照組，均經(jīng)結(jié)腸鏡檢查排除結(jié)直腸部位病變，其他實驗室檢查結(jié)果排除其他部位腫瘤或疾病。

1.2 血液指標的檢測 兩組研究對象(結(jié)直腸癌組在治療前)采集清晨空腹靜脈血3 mL，常溫下3 000 r/min離心10 min，取上層血漿-80℃低溫冰箱中保存待測。采用i2000全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國雅培公司)檢測血漿miRNA-200a、癌胚抗原和糖類抗原199等水平。

1.3 miRNA-200a的檢測方法 采用實時熒光定量PCR法檢測血漿中miRNA-200a水平。PCR儀為美國ABI公司StepOneTMReal-Time PCR儀；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司； PCR試劑盒及U6購自日本TaKaRa公司；Fast SYBR Green Master Mix及PCR相關(guān)耗材購自美國ABI公司。采用TRIzol試劑提取總RNA；所有溶液加二乙基焦磷酰胺至濃度為0.1 mol/L，振蕩混勻，37℃過夜，然后高壓(103.4 kPa、20 min)滅菌分解焦碳酸二乙酯。U6引物：5′CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、5′AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，miR-200a引物：5′CCTACGCCACAATTAACAAGCC-3′、5′GCCGTCTAACACTGTCTGGTA-3′。反應(yīng)體系包括5 μg總RNA，4 μl逆轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液和1 μl反轉(zhuǎn)錄酶混合液。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴格按照試劑盒(日本TaKaPa公司)說明書操作。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 變性10 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環(huán)。用美國ABI公司自帶的StepOne PCR系統(tǒng)分析軟件分析，采用U6作為內(nèi)參，按2-ΔΔCT法對目的基因進行相對定量檢測。

1.4 研究方法 (1)收集臨床資料，包括吸煙和飲酒史、年齡、性別，以及結(jié)直腸癌患者的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移情況等。(2)分析結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a水平與癌胚抗原和糖類抗原199水平的相關(guān)性。(3)分析血漿miRNA-200a對結(jié)直腸癌的診斷價值。(4)分析血漿miRNA-200a水平與結(jié)直腸癌腫瘤原發(fā)腫瘤-區(qū)域淋巴結(jié)-遠處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、腫瘤臨床分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用(x±s)表示，比較采用t檢驗或t′檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線進行診斷效能檢驗；血漿miRNA-200a水平與癌胚抗原、糖類抗原199水平的相關(guān)性采用Pearson檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象臨床資料及血液指標的比較 兩組年齡、性別、吸煙史、飲酒史等臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。而結(jié)直腸癌組外周血miRNA-200a相對表達水平、癌胚抗原和糖類抗原199水平均高于健康對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象臨床資料及血液指標的比較

2.2 結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a與癌胚抗原、糖類抗原199水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a水平與癌胚抗原水平(r=0.128，P=0.728)、糖類抗原199水平(r=0.446，P=0.365)均無相關(guān)性。

2.3 血漿miRNA-200a診斷結(jié)直腸癌的價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血漿miRNA-200a水平單獨診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積為0.791(P<0.001，95%CI:0.564～0.877)，敏感度和特異度分別為81.7%和74.3%。miRNA-200a聯(lián)合癌胚抗原或(和)糖類抗原199的診斷價值比單獨miRNA-200a診斷價值高。見表2、圖2。

表2 miRNA-200a單獨以及聯(lián)合癌胚抗原或(和) 糖類抗原199診斷結(jié)直腸癌的價值

圖2 血漿miRNA-200a單獨以及聯(lián)合癌胚抗原或(和) 糖類抗原199診斷結(jié)直腸癌的價值

2.4 結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、T分期、N分期結(jié)直腸癌患者的血漿miRNA-200a相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，而在M1期和Ⅲ+Ⅳ期結(jié)直腸癌患者的血漿miRNA-200a相對表達水平分別高于M0期和Ⅰ+Ⅱ期患者(均P<0.05)。見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a 相對表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(x±s)

3 討 論

miRNA是真核生物中一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其長度為20～25個核苷酸。研究表明，多個miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，可作為腫瘤診斷、治療和判斷預(yù)后的重要指標[6]。除了在腫瘤組織穩(wěn)定表達之外，miRNA也能夠穩(wěn)定存在于血液、尿液，且經(jīng)過反復(fù)凍融仍能保持相對穩(wěn)定的水平[7]。已有研究表明，結(jié)直腸癌患者血清或血漿中的miRNA水平會發(fā)生顯著改變，可作為診斷結(jié)直腸癌的重要生物學(xué)指標，例如miRNA-148a、miRNA-601、miRNA-760等[8-9]。因此，基于外周血的易獲得性和無創(chuàng)性，探索外周血中的miRNA水平對結(jié)腸癌診斷和預(yù)后評估的價值成為了當下的研究熱點。人類miRNA-200a定位于1號染色體36區(qū)，主要參與蛋白磷酸化、DNA結(jié)合、RNA代謝調(diào)控、小泡碎片等生物學(xué)過程[10]。miRNA-200a在結(jié)腸癌組織中的表達水平高于正常結(jié)腸組織，是影響患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子[11]。研究表明，miRNA-200a在6種結(jié)直腸癌細胞株中表達存在差異，其中在具有高轉(zhuǎn)移潛能的Lovo細胞中的表達最低，在成瘤但不轉(zhuǎn)移的細胞系HCT116中的表達最高；過表達miRNA-200a后，Lovo細胞的增殖和遷移能力明顯減弱、細胞同質(zhì)黏附能力增強且凋亡增加[12]。這提示miRNA-200a水平有可能成為結(jié)直腸癌有效的腫瘤標記物。本研究檢測了結(jié)直腸癌患者與健康對照者血漿miRNA-200a表達水平，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌患者血漿miRNA-200a表達水平較健康人群升高(P<0.05)，表明結(jié)直腸癌患者血漿中miRNA-200a水平升高，其可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)。但本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者外周血血漿中的miRNA-200a水平與癌胚抗原、糖類抗原199水平均無相關(guān)性，其原因可能為本研究納入的樣本例數(shù)較少所致。

本研究還分析了血漿中miRNA-200a水平對結(jié)直腸癌的診斷價值，結(jié)果表明miRNA-200a對結(jié)直腸癌有較高的診斷效能。癌胚抗原、糖類抗原199水平是臨床上輔助診斷結(jié)直腸癌的重要標記物，為了進一步提高結(jié)直腸癌的診斷準確率，本研究分析miRNA-200a與癌胚抗原、糖類抗原199水平聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的效能，結(jié)果顯示miRNA-200a聯(lián)合癌胚抗原或(和)糖類抗原199的診斷效果優(yōu)于單一的miRNA-200a。本研究還分析了miRNA-200a與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示外周血miRNA-200a水平可能與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，即發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和晚期的結(jié)直腸癌患者血漿中miRNA-200a水平更高，這與Zuberi等[13]的研究相似，表明外周血miRNA-200a水平升高與患者預(yù)后有一定的關(guān)系。

綜上所述，外周血miRNA-200a表達水平升高與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展可能存在密切相關(guān)，或可作為輔助診斷結(jié)直腸癌的標記物，聯(lián)合檢測外周血miRNA-200a以及傳統(tǒng)腫瘤標志物癌胚抗原、糖類抗原199水平可有效地提高結(jié)直腸癌的診斷準確率。然而本研究納入樣本例數(shù)較少，因此仍需要大樣本、多中心、長期隨訪的研究以進一步證實所得結(jié)論。