灰綠堿蓬多糖脫蛋白工藝研究

付建鑫，邵家威，張炳文，方奕珊，張桂香*

（1.濟南大學食品科學與營養系，山東濟南 250002；2.齊魯工業大學食品科學與工程，山東濟南 250353）

近年來，岸基濕地、灘涂等土壤鹽漬化現象日益嚴重，耕地土壤土質硬化，耕地資源緊缺，迫使人們不得不考慮開發利用鹽生植物資源，所以研究及推廣鹽生植物的種植勢在必行。灰綠堿蓬（Bunge）又名黃須菜，是一年生藜科堿蓬屬草本鹽生植物，多生長于灘涂及荒漠處，是鹽堿地的特征植物[1-2]。堿蓬在我國不僅分布廣泛，而且產量高。據統計，每年僅黃河三角洲地區的堿蓬產量就高達3.3105t[3-4]。堿蓬莖、葉含有豐富的礦物質、黃酮、皂苷，其種籽中含有大量的共軛亞油酸、花生四烯酸等不飽和脂肪酸[5-6]。醫學研究發現，堿蓬提取物中的黃酮、多糖具有抗氧化、降低血漿膽固醇功能，可用于心腦血管疾病的預防及中老年人的保健；其芽、葉分離物具有抑菌消炎等功效[7]，因此具有很高的研究價值。

目前國內外關于堿蓬的研究主要著眼于鹽地堿蓬、硬翅堿蓬的耐鹽機理研究及活性物質提取等方面[8]，對灰綠堿蓬多糖的提取、純化等的研究鮮見報道。蛋白本身具有熱敏感性，糖蛋白復合物在脫除蛋白質以后，多糖自身生物活性會明顯增加，因此，關于多糖脫蛋白的研究成為熱點。鑒于此，本研究以灰綠堿蓬為研究對象，測定了根、莖、葉及全株的基本營養成分并對灰綠堿蓬多糖的脫蛋白方式進行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

灰綠堿蓬，采自山東東營；堿性蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司；石油醚、無水乙醇、硫酸銅、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、氨水、TCA、(NH4)2SO4等試劑，均為分析純。

702A 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；PHS-3B pH 酸度計，賽多普利斯科學儀器有限公司；FA2004N 電子天平，上海上平儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰綠堿蓬基本成分的測定

蛋白質含量測定，按GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》執行；總糖含量測定，按GB/T 15672-2009《食品安全國家標準 食用菌中總糖含量的測定》執行；脂肪含量測定，按GB 5009.6-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》執行；黃酮含量測定，按GB/T 20574-2006《蜂膠中總黃酮含量的測定方法分光光度比色法》執行；皂苷含量測定，按GB/T 22464-2008《大豆皂苷》執行。

1.2.2 灰綠堿蓬多糖提取工藝

通過溶劑浸提法去除植株少量脂肪及大量可溶性色素[8-9]。過量正己烷回流脫脂4～6 h，將脫脂后的索式提取系統用少量水沖洗，以75%乙醇為溶劑進行色素沖洗，直至提取管內無顏色變化為止。稱量單位質量已處理的堿蓬干粉（200 目）于燒杯中，加入一定量的沸水，封膜密閉后于超聲清洗器中浸提。將冷卻沉降后的提取上清液在8 000 r/min 條件下離心10 min，取離心后的上清液旋轉蒸發濃縮，得到粗多糖提取液。400 mL 無水乙醇按照4:1（V/V）的比例緩慢倒入100 mL 粗多糖提取液中，并攪拌均勻，放置于4條件下冷藏，每隔3 h 攪拌一次，沉淀過夜后，傾倒上層清液。下層溶液在7 000 r/min 離心12 min 后，將沉淀用無水乙醇和石油醚洗滌多次后過HZ-800 大孔樹脂脫色，收集脫色后溶液冷凍干燥，即為堿蓬粗多糖。

1.2.3 多糖脫蛋白工藝

（1）TCA 脫蛋白

TCA 屬于有機弱酸類，它可以改變溶液體系中pH使其呈酸性，溶液中懸浮蛋白質在酸性條件下變性形成沉淀析出，蛋白質析出速度和脫除率與TCA 濃度直接相關[15]。將100 mL、10 mg/mL 脫色后的堿蓬多糖溶液按照1%、3%、7%、10%、15%的比例與30%粗多糖提取液（V/V）混合，攪拌30 min 后于200 W 功率下超聲10 min，用0.1 mol/LNaOH 調節pH 至7.8，使蛋白質沉淀，再以7 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白質含量，確定TCA 脫蛋白的效果及最佳條件[10]。

（2）Savage 脫蛋白

四氯化碳溶液又稱氯仿，具有極強的破壞作用，可以使蛋白質急劇變性，正丁醇可以溶解變性蛋白形成凝膠體體系利于分層。按照1:4（V/V）的比例將氯仿（CCl4）與正丁醇復配成Savage 溶劑，按照5:1（V/V）的比例將復配溶劑與脫色后的多糖溶液混合振蕩，并以1.5104r/min破碎機高速攪拌，移入分液漏斗后靜置分層，測定5 次脫蛋白的效果，確定Savage 脫蛋白法的效果及最佳脫蛋白次數[11]。

（3）(NH4)SO4沉淀法

蛋白質鹽析（salting out）是指溶液體系中的蛋白質隨著外源中性鹽（硫酸銨、氯化銨等）的加入而逐漸析出的現象。鹽溶液是強電解質，在溶液中完全電離，具有較高的溶解度。鹽離子會附著蛋白質表面的水膜爭奪水分子破壞水膜結構。另一方面，陰離子如Cl-可以結合蛋白質表面的，從而使蛋白質顆粒團聚形成沉淀析出。取100 mL、10 mg/mL 脫色后的灰綠堿蓬多糖溶液，用0.1 mol/L 的氨水溶液調節pH 至8.3 左右，按照1%、3%、7%、10%、15%的比例加入5 mol/L 的(NH4)SO4溶液，封口膜封閉錐形瓶口，劇烈振蕩后于85的水浴條件下保持40 min。反應完畢后，靜置到室溫，10 000 r/min 離心10 min，取上清液測定蛋白質含量，探究(NH4)SO4的最佳濃度[12]。

（4）酶-Savage 法

取100 mL、10 mg/mL 脫色后的灰綠堿蓬多糖溶液，按照1%、3%、7%、10%、15%比例加入堿性蛋白酶（按照每100 mL 溶液104U），使用0.1 mol/L NaOH 調節pH 至7.5，在37水浴保持3.5 h，反應完畢后在100水浴滅酶15 min，10 000 r/min 離心10 min，上清液再按照（2）所述操作1 次，取上清液測定蛋白質含量，確定最佳酶添加量[13]。

1.2.4 考馬斯亮藍法測定蛋白含量

（1）多糖溶液的配制

取堿蓬粗多糖用蒸餾水配置成10 mg/mL 粗多糖溶液，充分溶解后冷藏、靜置備用[14]。

（2）考馬斯亮藍G-250 的配制

取0.1 g G-250 溶于50 mL、85%無水乙醇中，超聲充分溶解，2 000 r/min 離心10 min，取上清液與100 mL、85%（w/V）的磷酸混合，用去離子水定容至1 L。

按照表1 依次加入溶劑，混合均勻后，取0.1 mL加入5 mL G-250 搖勻室溫反應10 min，595 nm 條件下測定吸光值，用去離子水做空白對照，制作標準曲線。

表1 標準曲線試劑量Table 1 The amount reagent of standard curve

蛋白質脫除率計算公式見式（1）。

2 結果與分析

2.1 灰綠堿蓬物質成分含量

表2 灰綠堿蓬物質成分含量Table 2 The content of each substance

2.2 堿蓬多糖脫蛋白的方法比較

2.2.1 TCA 脫蛋白的效果

圖2（見下頁）顯示了TCA 脫蛋白效果。由圖2 可知，隨著TCA 含量增加，脫除率呈擬線性增加，說明蛋白質脫除率逐漸增大，溶液中蛋白質含量逐漸減少。蛋白質脫除趨勢可以看出蛋白質的脫除效果對三氯乙酸呈現劑量依賴效應，在達到TCA 飽和濃度前，游離蛋白和結合蛋白會隨著TCA 增加而減少。除此之外，三氯乙酸也可能破壞糖苷鍵分解糖蛋白，因此10%TCA 用量效果最佳。

對于女性的上述角色定位及德性要求與儒家所建構的秩序體系是內在一體的。在儒家而言，“男女之別”只是人倫之起點，其目的在于建立“父子親”“君臣義”的等差性社會秩序。因而盡管人們認為女性通常被限定于“內”和“私”的領域之中而無緣于公共事務，但實際上，儒家女性是被裹挾于家族與政治的“公”之中并為“公”服務的。從公私觀上考察，可以清晰地看出其邏輯線索。

2.2.2 Savage 脫蛋白的效果

圖3 顯示了Savage 脫蛋白的效果，由圖可知，隨著脫蛋白次數的增加，蛋白質脫除率明顯增大，脫蛋白次數為4 次時，蛋白質含量趨于穩定，此時蛋白質脫除率達到最大，為89.14%。李小榮等[16]對倒卵葉五加多糖脫蛋白結論中，Savage 法脫蛋白為5 次時，蛋白質最佳脫除率為80.32%；對蒲公英多糖脫蛋白效果研究中發現，相同方法處理6 次，蛋白質脫除率穩定在80.21%[17]。整體來看，Savage 法具有較好的脫蛋白能力和普適性，灰綠堿蓬多糖Savage 法脫蛋白處理4 次較好。

2.2.3 (NH4)2SO4沉淀法脫蛋白的效果

圖4 顯示了(NH4)2SO4脫蛋白效果。如圖4 所示，隨著(NH4)2SO4濃度增大，蛋白脫除率增大，蛋白鹽析形成沉淀，溶液中蛋白質含量逐漸減少。鹽析法主要針對游離蛋白質顆粒，同時(NH4)2SO4濃度對鹽析效果存在較大影響，高濃度鹽溶液與體系存在濃度差，因此脫蛋白效果較好。(NH4)2SO4濃度為10%時，蛋白質脫除率最高為15.36%。

2.2.4 酶-Savage 法脫蛋白的效果

2.3 脫蛋白方式的選擇

選取最佳脫蛋白方式主要考慮蛋白質脫除率和多糖保留率兩個指標，以多糖為研究目標，脫除游離蛋白及糖蛋白可以更好地測定多糖的生物活性。如表3 可知，TCA法和鹽析法蛋白質脫除率分別為38.43%、14.24%，蛋白質脫除率較低，無法得到高純度的多糖。比較Savage 法和酶-Savage 法，兩種脫蛋白工藝的都具有較好的蛋白質脫除效果，除此之外，酶-Savage 法的多糖保留率高于Savage 法，在酶添加量7%、Savage 溶液處理一次，此時多糖保留率達到67.27%。因此，灰綠堿蓬多糖最佳脫蛋白方法為酶-Savage 法。

表3 脫蛋白效果與多糖保留率/%Table 3 Deproteinization effect and polysaccharide retention rate/%

3 結論

通過測定灰綠堿蓬根、莖、葉的基本營養物質成分，發現全植株水分含量較高而脂肪含量極少，含有部分蛋白質，葉片中的總黃酮、總皂苷和總糖含量最多。在脫蛋白研究中，比較了Savage 法、鹽析法、TCA 法和酶-Savage 法脫蛋白效果。考慮到最低溶劑使用量和脫蛋白效果最優，選擇酶-Savage 法作為灰綠堿蓬多糖的脫蛋白方式，酶添加量為7%，Savage 溶液處理一次蛋白質脫除率80.71%，多糖保留率為67.27%，此時脫蛋白效果和多糖保留率最好。