7株木霉菌對火龍果3種病原菌的拮抗作用

陳迪 侯巨梅 邢夢玉 彥哲 劉銅

摘? 要：本研究利用對峙培養及發酵液、揮發性物質的抑菌活性測定，分析了7株木霉菌對火龍果潰瘍病菌、煤煙病菌和白絹病菌的拮抗作用，并測定木霉菌幾丁質酶活性。結果表明：通過對峙培養發現7株木霉菌對火龍果3種病原菌均有一定的抑制作用，其中木霉菌HL135、FJ069和2325-2分別對火龍果潰瘍病菌、煤煙病菌和白絹病菌抑制率最大，其抑制率分別為（67.60±0.85）%、（84.85±5.25）%和（80.63±1.20）%。7株木霉菌的發酵液和揮發性物質對3種病原菌也有不同程度的抑制作用。通過對木霉菌幾丁質酶活性測定，發現木霉菌SC012具有較高的幾丁質酶活性。這些結果將為開發木霉菌復合制劑防治火龍果病害提供理論基礎。

關鍵詞：木霉菌;發酵液;揮發性物質;幾丁質酶;拮抗活性;火龍果;病原菌

中圖分類號：S476.1? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The antagonistic activity of seven Trichoderma strains against three pathogens of pitaya were analyzed using confront test and determination of antifungal acitivity of fermentation broth and volatile substances， and the chitinase activity of the Trichoderma strains were measured. The seven Trichoderma strains inhibited the growth of three pathogens to some extent. In dual culture， Trichoderma strain HL135， FJ069 and 2325-2 inhibited Neoscytalidium dimidiatum， Blastocladia pringsheimii and Sclerotium rolfsii with the highest inhibition rate of （67.60±0.85）%， （84.85±5.25）% and （80.63±1.20）%， respectively. The fermentation broth and volatile substances of the seven Trichoderma strains had different degree of inhibition on the three pathogens of pitaya. The chitinase activity of Trichoderma SC012 was higher than that of other strains by the determination of chitinase activity. The results would provide a theoretical basis for the development of Trichoderma compound agents to control pitaya disease.

Keywords： Trichoderma; fermentation broth; volatile inhibitors; chitinase; antagonistic activities; pitaya; pathogen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.018

火龍果（Hylocereus undatus Britt. et Rose）屬于仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus），是一種具有較高經濟價值和營養價值的集水果、花卉為一體的熱帶、亞熱帶果樹，被譽為保健食品和果品珍品[1]，于20世紀90年代初引種到中國臺灣。隨著種植規模的擴大，火龍果已逐步成為我國南方地區農民經濟收入的重要來源。在火龍果種植過程中，由于種植集中，種植品種單一化，火龍果潰瘍?。∟eoscytalidium dimidiatum）、白絹?。⊿clerotium rolfsii）和煤煙?。˙lastocladia pringsheimii）逐年加重，致使火龍果產量和品質急劇下降。目前，這些病害的防治主要以化學防治為主，但化學防治會對人類健康和生態環境造成危害和破壞作用，也易導致病原菌產生抗藥性。因此，尋求安全有效且環境友好的病害防治手段將有助于火龍果產業的綠色健康發展。

木霉菌（Trichoderma spp.）是廣泛分布于森林、農田等潮濕生境中土壤、腐木、落葉以及真菌子實體上的拮抗微生物[2]，在生物防治中的應用和研究非常廣泛。木霉菌對植物病原菌的廣譜拮抗作用，已被用于曲霉菌（Aspergillus spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）、假單胞菌（Pseudomons adaceae）、輪枝孢菌（Pseudomons adaceae）等多種病原菌引起的植物病害的防治[3-6]。本研究擬通過測定7株木霉菌與火龍果3種病原菌的對峙培養、發酵液和揮發性物質抑制作用及幾丁質酶的活性，研究木霉菌對火龍果病原菌的拮抗效果，為下一步開發木霉菌復合制劑防治火龍果病害提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菌株? 靶標病原菌為引起火龍果潰瘍病的新暗色柱節孢（Neoscytalidium dimidiatum）、煤煙病的芽枝霉（Blastocladia pringsheimii）和白絹病的齊整小核菌（Sclerotium rolfsii），均由海南大學植物保護學院謝昌平副教授惠贈。哈茨木霉2325-2（T. harzianum）、哈茨木霉XJ035（T. harzianum）、棘孢木霉FJ069（T. asperellum）、棘孢木霉HL119（T. asperellum）、棘孢木霉HL135（T. asperellum）、棘孢木霉JX013（T. asperellum）和棘孢木霉SC012（T. asperellum），均由海南大學植物保護學院木霉菌研究課題組提供。

7株木霉菌震蕩培養4 d后檢測幾丁質酶活性，結果表明：木霉菌SC012的幾丁質酶活性最高，達到1.83 U/mL，與其他木霉菌株的幾丁質酶活性差異顯著（P<0.05），而木霉菌FJ069的幾丁質酶活性最低，為0.83 U/mL，只有木霉菌SC012幾丁質酶活性的45%，結果表明不同木霉菌株產生幾丁質酶的能力存在一定的差異。

3? 討論

木霉菌對環境的適應能力強，生長速度快，能夠搶奪病原菌的營養和生存空間，致使病原菌的生長受到抑制[11]。平板對峙試驗可直觀地觀察到木霉菌對病原菌的抑菌效果，因此可以快速篩選出具有較強拮抗作用的木霉菌株。夏海波等[12]用平板對峙實驗，篩選出8株對蔬菜病害防治效果良好的菌株。張建等[13]篩選得到9株棘孢木霉，對桑葚菌核病菌的抑菌率達到80%以上。Jiang等[14]通過對峙培養、細胞學和超微結構顯示，棘孢木霉CGMCC 6422對辣椒疫霉病具有較強的抑制作用。本研究通過對峙培養試驗，篩選到對火龍果煤煙病菌具有較好拮抗效果的木霉菌FJ069和JX013，對火龍果白絹病菌具有較好拮抗效果的木霉菌2325-2，抑菌率均達80%以上。而所有供試木霉菌對火龍果潰瘍病菌的抑制率均不高，表明對于生長速度較快的病原菌，木霉菌難以通過快速生長占領其生存空間，致使抑制率降低。因此在利用木霉菌防治病原菌時，應以預防為主，才能達到更好的防治效果。

幾丁質酶是木霉菌產生的細胞壁降解酶類（CWDEs）之一[15]，木霉菌在重寄生過程中可以通過釋放細胞壁降解酶降解病原菌的細胞壁來殺死病原菌，在絲狀真菌中，木霉菌所含的幾丁質酶基因是最多的[16]。木霉菌可以產生抗真菌活性的幾丁質酶和水解幾丁質酶，且不同幾丁質酶對病原菌的拮抗活性表現出特異性，部分幾丁質酶無拮抗真菌的活性[17]。本研究測定了7株木霉菌的幾丁質酶活性，其中木霉菌SC012和HL135具有較高的幾丁質酶活性，這2株木霉菌在發酵液和揮發性物質抑菌試驗中均表現出了較好的抑菌效果，但在對峙培養中抑菌效果較差，可能是由于木霉菌SC012和HL135的生長速度較其他木霉菌慢，不能快速地占領病原物的生存空間，以及其幾丁質酶中拮抗真菌活性的幾丁質酶較少所致。Lorito等[18-20]通過研究指出，木霉菌幾丁質酶只有幾種同時具有水解幾丁質活性和抗真菌活性。李華[21]也發現木霉菌對病原菌的生防能力與幾丁質酶活性高低沒有直接的相關性。因此，在評定木霉菌的拮抗作用時，應當結合多種影響因子進行分析。

木霉菌可以產生較豐富的抗生次生代謝產物，目前已經確定的抗生代謝產物已經超過了140種，而且不同菌株之間產生的次生代謝產物種類存在一定差異[22]。例如，陳凱等[23]發現綠色木霉LTR-2產生的吡喃酮類物質5，6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮在20 mg/L的濃度下對11種植物病原菌均有抑制作用。Liu等[24]從哈茨木霉中提取的6種蒽醌類化合物，以及Vinale等[25]從木霉T. cerinum的培養濾液中分離出一種新的羥基內酯對灰葡萄孢菌具有抑制作用。本研究中，7株木霉菌的發酵液對3種病原菌均有抑制作用，但木霉菌HL135對火龍果煤煙病菌的抑制率達（50.00±3.77）%，而木霉菌FJ069對火龍果煤煙病的抑制率僅為（34.78±0.00）%，表明木霉菌產生抗生次生代謝物的種類有一定的差異。

除了產生次生代謝產物外，木霉菌還可以產生一些抗病原真菌的活性揮發性物質，其中揮發性物質吡喃酮-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（簡稱6PP）研究較為廣泛，在多種木霉菌中被檢測到。例如，Vos等[26]報道了木霉菌揮發性物質6PP對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和灰葡萄孢菌均具有抑制作用。另外木霉菌產生的一些揮發性小分子化合物能夠誘導植物的抗性反應，例如，Martínez-Medina等[27]報道了棘孢木霉T-34和哈茨木霉T-78產生的揮發性物質能夠引發擬南芥的系統性防御反應，提高對灰霉病的抗性，且能促進根部對鐵離子的吸收。本研究結果顯示，木霉菌產生的揮發性物質對病原菌有一定的抑制作用，其中，木霉菌SC012和木霉菌HL135的揮發性物質都顯示出較強抑菌活性，表明這2株木霉菌可能產生具有抑菌活性的揮發性物質。供試木霉菌揮發性物質對病原菌的抑制率在3.49%～37.84%之間，低于對峙培養對病原菌的抑制率（57.58%～84.85%）以及發酵液對病原菌的抑制率（26.09%～77.08%），表明木霉菌產生的揮發性物質對病原菌的抑制率不高，暗示了木霉菌產生揮發性物質的主要作用不僅僅為抑菌，可能還具有誘導植物抗性等其他作用。目前對于木霉菌揮發性物質的研究不多，對于揮發性物質的成分以及作用等尚待進一步挖掘和研究。

木霉菌種類繁多，生防機制復雜[28]，在生防過程中對病原菌的生防機制包括競爭作用、重寄生作用、產生抑菌物質、誘導植物產生抗性以及促進植物生長等作用，且菌株之間的生防能力也存在著較大的差異[29]。在本研究中，木霉菌HL135有較高的幾丁質酶活性，且其揮發性物質、發酵液均有較強的抑菌率，但其發酵液對火龍果潰瘍病菌抑制效果較差，木霉菌FJ069的幾丁質酶活性最低，但其發酵液對火龍果潰瘍病菌的抑制率都較其他6株木霉菌高，雖然木霉菌JX013的幾丁質酶活性不高，且其對火龍果白絹病菌、火龍果潰瘍病菌的抑制效果均不理想，但是其對峙培養、發酵液以及揮發性物質對火龍果煤煙病菌有著良好的抑制效果。因此，在篩選生防菌的時候，應該結合多因素篩選方法，才能夠合理地篩選出針對不同病原菌、不同拮抗特點的生防菌株。針對不同木霉菌對不同病原菌的防治效果具有差異的特點，可以采用不同木霉菌復配使用，以提高對多種病原菌的綜合防治效果。

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