四川茶樹資源遺傳多樣性及高EGCG資源篩選

謝文鋼 李曉松 譚禮強 陳瑋 楊雪梅 文維奇 高先榮 唐茜

摘? 要：為促進四川茶樹資源評價與茶樹特異資源鑒定，本文利用11對SSR引物對109份四川茶樹資源進行了遺傳多樣性和親緣關系分析，并對其夏梢的茶多酚含量及兒茶素組分進行分析測定。結果表明：11對SSR引物共擴增出35個觀測等位基因，遺傳多態信息量（PIC）、Neis多態性指數及Shannon信息指數的平均值分別為0.58、0.58、0.98。將109份種質資源聚為7個類群，在分子水平上具有較大差異性，材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性。同時對茶多酚及兒茶素組分進行分析，109份材料夏梢的茶多酚為（21.59%±0.25%）～（30.56%±0.72%）（平均25.17%±1.87%），兒茶素為21.82%～25.04%（平均23.29%），酯型兒茶素為17.91%～22.08%（平均19.46%），EGCG為9.71%～16.24%（平均13.86%）。結果顯示，四川茶樹資源遺傳背景較復雜，遺傳基礎較寬且差異較大，具有豐富的遺傳多樣性。從中篩選出一批特異資源材料，其中高兒茶素資源8份（>19%），高酯型兒茶素資源10份（>15%），高EGCG資源14份（>13%），超高EGCG資源的5份（>15%）。為核心茶樹資源圃建設及高EGCG資源鑒定評價提供理論依據。

關鍵詞：茶樹;SSR;遺傳多樣性;表沒食子兒茶素沒食子酸酯;特異資源

中圖分類號：S571.1? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to protect and exploit tea specific resources in Sichuan Province， 11 simple sequence repeat （SSR） primers were used to determine the genetic polymorphism and genetic relationship among 109 tea germplasms， and the contents of tea catechins and total polyphenols in summer tea shoots were analyzed. SSR analysis showed that a total of 35 alleles were amplified. The average value of polymorphism information content （PIC）， Neis polymorphism index （H） and Shannon information index （I） was 0.58， 0.58 and 0.98， respectively. 109 germplasm resources were divided into seven groups， which showing great differences at the molecular level. There was no obvious correlation between genetic and geographical distance among the material resources. At the same time， the components of tea polyphenols and catechins in 109 germplasm resources were analyzed. The total contents of tea polyphenols， catechin， ester-catechin and epigallocatechin gallate ranged from 21.59%±0.25% to 30.56%±0.72%， 21.82% to 25.04%， 17.91% to 22.08%， and 9.71% to 16.24%， respectively. The average value was 25.17%±1.87%， 23.29%， 19.46% and 13.86%， respectively. These results showed that tea genetic diversity was rich in Sichuan. Those genetic backgrounds were complex， and the genetic basis of variation was large. A series of specific genetic resource were screened out， including eight high catechin resources （more than 19%）， ten high ester catechin resources （more than 15%）， 14 high EGCG resources （more than 13%）， and five high EGCG resources （more than 15%）. These results would provide a theoretical basis for constructing tea tree nursery and evaluating high EGCG resources.

Keywords： tea （Camellia sinensis）; simples sequence repeat; genetic diversity; epigallocatechin gallate; special germplasm.

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.009

茶樹種質資源是開展茶樹種質創新、育種和新產品開發的重要基礎[1]。近年來，為助推茶產業轉型升級，亟需加強四川茶樹品種資源的評價和利用，進一步開發利用優質、特異資源選育茶樹良種。而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚具有生理活性和廣闊用途的最關鍵的核心成分，是影響茶葉品質的關鍵因子之一，目前還不能人工合成，且茶葉是其唯一來源[2-3]。因此，云南、廣東、福建、陜西等省均加強了優質特異茶樹資源的篩選和鑒定，特別是高EGCG資源的研究[3-6]。

四川茶樹種質資源豐富，且唐曉波等[2]發現四川中小葉群體種EGCG的春夏秋梢平均值高于云南大葉種。高EGCG的特異茶樹種質資源已用于深加工、功能性產品的開發及特異優質品種選育。但EGCG含量的遺傳模式是微效多基因控制的數量性狀[7]，使高EGCG茶樹品種的傳統育種方法耗時長和效率低[8]。微衛星DNA序列（simples sequece repeat，SSR）標記被認為是目前遺傳多樣性分析或種質資源鑒定和評價最為有效的工具之一[9]。近年來，國內學者在SSR標記分析茶樹資源的遺傳多樣性的基礎上，進行了兒茶素含量等重要性狀的QTL定位與性狀鑒定等[10-15]。研究發現兒茶素含量受年度影響較小[7]，促進了對高EGCG資源的篩選研究。本課題組選取四川中小葉群體種中具有代表性的109份資源材料為研究對象，應用SSR標記進行遺傳多樣性分析，同時對這些材料進行高EGCG資源的篩選評價，旨在了解其多樣性及篩選高EGCG茶樹資源，為核心茶樹資源圃建設及高EGCG資源鑒定評價提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料取自四川省茶樹種質資源圃（10312′E，3012′N）。供試材料為四川農業大學茶樹育種團隊和名山茶樹良種繁育場從四川名山區、沐川縣、滎經縣、北川縣、青川縣等茶區收集的四川中小葉群體種單株，經扦插繁育后移栽的株系，每份采用雙行雙株栽植，面積9 m2（1.5 m×6.0 m），共109份（表1）。采摘供試茶樹材料完整、無病蟲害感染的1芽1葉新梢，用錫箔紙包裹采用液氮速凍后，保存在?80 ℃冰箱中，備用。

1.2? 方法

1.2.1? 提取DNA、PCR擴增及產物檢測? ?用植物DNA提取試劑盒（DP305）提取DNA。本研究從王麗鴛等[16]、Tan等[17]、李慧[18]、王馨語[19]報道的SSR標記中選取30對引物對其基因組DNA模板進行擴增，選出的多態性較高、條帶清晰且重復性好的11對核心引物，委托深圳華大基因有限公司合成，引物信息（見表2）。參照王麗鴛[20]的SSR-PCR反應體系及擴增程序設計。數據處理采用人工讀帶的方法，按照分子量大小，從大到小按照A、B、C、D、E等依次記錄條帶，缺失條帶以“XX”表示，記錄每個參試品種的基因型[21]。利用軟件Popgene統計分析每對引物擴增的多態性信息量（polymorphism information content， PIC）、Shannon信息指數（shannon′s information index， I）、Neis多樣性指數（H）、觀測等位基因數（number of alleles， Na）、有效等位基因數（effective number of alleles， Ne）、近交系數（Fit）、遺傳分化系數（Fst）、基因流（Nm）。多態性信息量（PIC）用其簡化公式PIC=1-∑Pi2，Pi表示第i個等位基因位點出現的頻率[22-23]。

1.2.2? 茶多酚類成分檢測? ?2017年夏，采摘四川省茶樹種質資源圃109份供試材料的新梢，標準為1芽2葉，以同等條件下生長的福鼎大白茶作為對照。采用微波殺青制成生化樣。茶多酚（tea polyphenol，TP）含量采用GB/T 8313?2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中的福林酚法測定[24]，后選取其中茶多酚含量高的材料，采用ISO 14502?2?2005中的《高效液相色譜法》測定其兒茶素組分[25]。兒茶素品質指數= （EGCG+ECG）/EGC×100[26]。

1.3? 數據處理

利用SPSS統計軟件進行主成分分析，運用NTsys軟件計算各供試茶樹材料的Neis遺傳距離[27]，并構建（Neighbor-Joining）系統進化樹，進行聚類分析。

2? 結果與分析

2.1? SSR標記遺傳多樣性及群體種遺傳分化

使用Popgene軟件對供試材料SSR標記進行分析。結果表明（表3），有效等位基因數目（Ne）為1.00～3.13（平均2.48）;共檢測到觀測等位基因數（Na）35個（平均3.18）;多態性信息量（PIC）為0.45～0.68（平均0.58）;Shannon信息指數（I）為0.70～1.18（平均0.98）;Neis多態性指數為0.45～0.68（平均0.58）。各供試材料在11個位點的遺傳分化見表3，總近交系數Fit范圍為0.02～0.28（平均0.15），說明在供試材料間存在少量的近交;遺傳分化系數Fst介于0.51～0.64之間（平均0.57），說明57.43%的遺傳變異存在于地區間，42.57%存在于地區內部;基因流Nm在0.14～0.24間波動，平均0.19。

2.2? 聚類分析

根據Neis遺傳距離構建109份茶樹資源的聚類圖（圖1）。109份供試材料被分為7個類群，第Ⅰ類群包含8份材料，分別是天全05、安縣04、名山05、名山14、興文04、邛崍03、滎經01、平武07。第Ⅱ類群包含8份材料，分別是名山04、名山11、北川01、南江01、邛崍05、南江04、名山02、長寧01。第Ⅲ類群只包括了2份材料，天全06和邛崍06。第Ⅳ類群包含15份材料，分別是滎經04、滎經05、名山01、平武03、旺蒼01、安縣05、興文02、北川02、安縣01、雨城01、平武06、安縣07、邛崍07、安縣06、興文01。第Ⅴ類群包含了6份材料，名山03、名山10、旺蒼03、名山15、名山08和滎經02。第Ⅵ類群包含10份材料，天全03、天全04、雨城02、北川08、洪雅02、長寧02、平武05、平武04、雨城05、青川06。第Ⅶ類群包含大部分材料，共60份。

2.3? 高EGCG資源篩選

2.3.1? 茶多酚差異性分析? 對109份供試材料及對照品種福鼎大白茶的茶多酚進行檢測分析（見表4）表明，供試材料的茶多酚含量為（21.59%±0.25%）～（30.56%±0.72%）（平均25.17%±1.87%），其中旺蒼07最高，為30.56%±0.72%，其次是平武07、沐川06、平武06、滎經05（均>29%）。北川03最低，為21.59%±0.25%。旺蒼07、平武07、沐川06、平武06、滎經07、名山09等材料茶多酚含量均較高。

2.3.2? 供試材料兒茶素組分分析? 兒茶素是茶葉中茶多酚的主要成分，約占總量的70%～80%。從表5～6可以看出，20份供試材料夏茶的兒茶素組分總量為21.82%～25.04%（平均23.38%），旺蒼07最高，較高的材料有8個（均>23%），且均高于對照（17.66%）。非酯型兒茶素含量為2.34%～ 6.41%（平均4.03%），其中平武06最高，天全05（4.94%）和名山09（4.79%）次之，沐川06最低。酯型兒茶素含量為17.91%～22.08%（平均19.46%），其中沐川06最高，較高的有10個材料（>19%），且均高于對照（為13.61%）。EGCG含量為9.71%～16.24%（平均13.86%），沐川06最高，較高的有旺蒼07、滎經07、平武07、名山09（均>15%），而>13%的材料有14個，對照最低。兒茶素品質指數在505.70～1578.91之間，其中，沐川06最高，天全06最低，均高于對照（462.08）。兒茶素品質指數較高的有沐川06（1578.91）、洪雅05（1273.57）、長寧04（1260.56）、旺蒼05（1177.19）、平武07（1067.40）。

3? 討論

地區內和地區間遺傳變異信息是建立核心種質和制定物種保護策略的重要參考依據[28]。綜合多態性信息量、基因多樣性指數和遺傳信息指數等分析，四川地方茶樹資源豐富，遺傳多樣性較高，與劉振等[29]西南茶區茶樹資源的結果相吻合。Roy等[30]，Liu等[31]和Joshi等[32]研究均發現茶樹的遺傳變異主要來源于地區之間。而本研究中遺傳分化系數Fst介于0.51～0.64之間（平均0.57），發現不僅地區之間，同一地區內茶樹的遺傳變異也會引起地區內部的個體間差異，可見四川省茶樹的遺傳分化或遺傳變異受地區間和地區內部的共同影響。本研究中基因流Nm平均0.19，說明各群體間基因流受阻（Nm<1[33]），群體走向遺傳分化。造成各群體間基因流受阻的原因可能是由于茶樹是異花授粉植物，而四川中小葉茶樹群體種分布廣，且多分布在山區，地理位置和地形阻礙了個/群體間的基因交流。

在育種工作中應用Neis遺傳距離的聚類分析的結果選配親本組合，對作物雜種優勢的利用具有一定指導意義[34]。本研究109份茶樹資源間的平均遺傳距離為0.08，其中北川01和名山05的遺傳距離最大，為0.36，旺蒼03和北川05的遺傳距離最小，為0.000012。模型聚類結果也表明四川省茶樹遺傳結構并不按照地區差異進行劃分，材料來源地間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性，有少部分同一來源地的材料分散在各個類群。可見，自然選擇或地理環境對不同地區茶樹變異的影響具有一定的平行性，而且這種生活環境的異質化所造成的不同地區的差異是茶樹主要的變異來源，同時由于自然雜交、自然和人工選擇等原因造成的遺傳變異也引起地區內部的個體間差異。這與Yao等[35]研究西南地區茶樹資源的結果有些類似，可能是因為引種交流導致少部分基因在不同地區間滲入。

茶多酚與茶葉品質和保健價值密切相關，已廣泛應用在食品、醫藥、日用化工等領域。國內學者對高茶多酚資源進行了一定的篩選研究。虞富蓮等[36]篩選出高茶多酚（茶多酚>34%）的資源9份，而楊亞軍等[37]篩選出茶多酚>38%的資源4份，但這些高茶多酚資源多來自云南和廣西，均為大葉或特大種。而本研究材料以四川茶區的中小葉種為主，其茶多酚含量相對較低，未發現高茶多酚資源。從各產茶縣（區）看，平武和旺蒼的資源多酚含量較高，而邛崍的資源多酚含量較低。兒茶素組分總量為21.82%～25.04%，平均為23.29%，其中有8個資源含量較高（>23%）。酯型兒茶素含量為17.91%～22.08%，平均為19.46%，大部分資源屬于高酯型兒茶素資源（高酯型兒茶素>19%[3]）。

EGCG不能人工合成，茶樹是EGCG的唯一來源。提高茶葉產品中酯型兒茶素含量的關鍵在于篩選出高EGCG含量的茶樹品種資源[38]。國內學者對高EGCG茶樹資源的標準有一定的爭議。林金科等[39]參照茶多酚>34%為高茶多酚資源，EGCG一般占40%，則認為EGCG含量>13%;鄭紅發等[40]以國內外市場的銷售需求為依據，認為EGCG含量>10%。同時加強了高EGCG資源的篩選鑒定工作。鄭紅發等[40]、龔志華等[41]發現現有主栽品種的EGCG含量在4.3%～9.8%之間，認為從現有主栽茶樹品種中很難篩選出高EGCG資源，只能從其他特異的地方資源中進行篩選。通常學者們認為在一些特異的高茶多酚品種中篩選出高EGCG含量的品種資源可能性很大。虞富蓮等[36]、楊亞軍等[37]、尚衛瓊等[42]、劉本英等[4]、魏勇[5]、蔣堃等[6]從云南、廣西、廣東和陜西茶區地方資源中篩選出一批高EGCG資源，其EGCG含量在9%～13%之間。而EGCG>13%的特異資源，僅林金科等[3]、張凱等[43]分別從福建、川渝茶區篩選出11份、1份資源。唐曉波等[2]研究發現四川中小葉>云南大葉>南江大葉。因此，大葉種比中小葉種茶樹具有較高的茶多酚和兒茶素總量，而中小葉種茶樹EGCG含量較高。同時林金科等[39]通過不同生長季節EGCG含量差異分析，認為大多數茶樹品種或株系（82.15%）春季>夏季>秋季;而少數品種或株系（82.15%）夏季>春季>秋季。而本研究從四川中小葉群體種中選取具有代表性的109份資源材料進行EGCG篩選與鑒定工作。本研究材料夏梢EGCG占兒茶素總量比例較高（43.60%～66.50%），其含量為9.71%～ 16.24%，平均為13.86%。發現EGCG含量>15%的材料有5個，可作為高EGCG特異茶樹的育種材料。兒茶素品質指數為505.70～1578.91，均高于對照（462.08）。發現兒茶素品質指數>1000的材料有5個，可作為優質綠茶的育種材料。

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