巴西橡膠樹MADS-box基因家族6個成員的染色體物理定位

陶志強 張宇航 王英 高和瓊 莊南生

摘? 要：MADS-box基因家族廣泛分布于真核生物中，巴西橡膠樹的MADS-box基因家族主要參與花形態建成，對生殖生長起到重要的調節作用。目前，MADS-box基因家族的26個相關基因已被克隆分析，但它們在染色體上的具體位置還未確定。本研究以巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種為材料，將MADS-box基因家族的6個成員（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1）定位在細胞核染色體上，通過雙探針熒光原位雜交技術（FISH）對巴西橡膠樹MADS-box基因家族的這6個成員在細胞核染色體上進行物理定位分析。結果表明：MADS-box基因家族的6個基因分別位于不同的染色體上，其中HbAGL15、HbAG8、HbAG30和HbSVP1基因定位在第4、5、7和8號染色體長臂上，其信號位點到著絲粒的平均百分距離是11.85、39.71、48.94和6.70;HbTT16和HbAP1基因定位在第1和13號染色體短臂上，其信號位點到著絲粒的平均百分距離是22.19和18.01。本研究結果揭示了巴西橡膠樹MADS-box基因家族的6個成員在細胞核染色體上的實際位置，展現家族基因之間的分布特點和連鎖遺傳關系，不僅豐富了橡膠樹分子細胞遺傳學信息，也為橡膠樹的分子輔助育種和比較基因組學研究提供了分子細胞遺傳學的科學理論依據。

關鍵詞：巴西橡膠樹;MADS-box基因家族;熒光原位雜交（FISH）;物理定位

中圖分類號：Q23? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The MADS-box gene family is widely distributed in eukaryotes. The MADS-box gene family of Hevea brasiliensis is mainly involved in flower morphogenesis and plays an important role in regulating reproductive growth. At present， 26 related genes of the MADS-box gene family have been cloned and analyzed， but the specific positions on the chromosome have not been determined. Six members of the MADS-box gene family （HbAGL8， HbAG15， HbAGL30， HbTT16， HbAP1 and HbSVP1） of ‘Reyan 7-33-97 were localized on the nuclear chromosome. Physical localization analysis of the six genes on the nuclear chromosome was performed using dual-probe fluorescence in situ hybridization （FISH）. The results showed that the six genes were located on different chromosomes. HbAGL15， HbAG8， HbAG30 and HbSVP1 genes were located on the long arm of chromosome 4， 5， 7 and 8 with PDCS （percent distance from centromere to the signal site） 11.85， 39.71， 48.94 and 6.70， respectively. HbTT16 and HbAP1 gene were located on the short arm of chromosome 1 and 13 with PDCS 22.19 and 18.01， respectively. This study reveals the actual position of the six genes of H. brasiliensis on the nuclear chromosome， shows the distribution characteristics and linkage genetic relationship between family genes， which not only enriching molecular cytogenetics information， but also providing scientific theoretical basis for molecular assisted breeding and comparative genomics research of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; MADS-box gene family; fluorescence in situ hybridization （FISH）; physical localization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.001

MADS-box基因家族是一類序列相對保守的基因家族，它編碼的蛋白具有激活或抑制目的基因轉錄表達的作用，廣泛分布于真核生物中，最先在Minichromosome Maintenance（酵母菌代謝調節因子）[1]、Agamous（擬南芥花器官發育決定因子）[2]、Deficienns（金魚草花器官發育決定因子）[3]和Serum Response Factor（人類血清反應因子SRF4）[4]4個基因的研究中確定其存在，因此，取各基因的首字母而命名為MADS-box基因家族。

前人對于MADS-box基因的研究最早是從擬南芥和金魚草的花形態突變體開始的[5]，深入研究后，不僅從番茄[6]、葡萄[7]、荷花[8]、小麥[9]等植物中克隆出MADS-box基因家族相關基因，還發現MADS-box基因除了與花形態建成調控[10]有關外，還在促進根的形成[11]、分生組織的分化[12]、開花時間的調控[13]、花粉成熟[14]、種子和果實發育成熟[15-16]等眾多方面發揮著重要作用，與植物的生長發育密切相關。

在橡膠樹MADS-box基因家族的相關研究中，Dornelas等[17]發現HbLFY基因在產生花序的側分生組織和所有花分生組織中均有表達，推測HbLFY與植物開花相關;華玉偉等[18]對HbFCA基因進行克隆與功能分析，推測HbFCA基因參與植物開花起始的調節;王輝等[19]克隆了MADS27基因，推測在開花過程中起調控作用;魏利然等[20]對HbMADS4基因進行克隆與功能分析，推測其作為一個負調控因子調控合成天然橡膠;王亞杰[21]克隆并功能驗證了MADS-box家族的26個基因，發現該家族相關基因在莖尖、花器官顯著高調表達，推測其在花形態建成和生殖發育過程中起顯著作用。

本研究以巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種古銅期嫩葉為材料，制備染色體標本，利用熒光原位雜交技術對MADS-box基因家族中的HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1共6個基因進行染色體定位，從而揭示MADS-box基因家族分別在細胞核染色體上的實際位置，同時分析各個基因之間的分布特點，這有利于完善功能基因的分子細胞遺傳學信息，為MADS-box基因功能研究提供新的理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以橡膠樹無性系‘熱研7-33-97古銅期葉片稍微展開的嫩葉為材料;應在天氣晴朗且光照充足的上午采摘樣品。DNA提取材料為黃綠色（減少DNA提取時色素的污染）的橡膠樹嫩葉（圖1B）。制備染色體標本的橡膠樹古銅期嫩葉（圖1A）應先于飽和對二氯苯溶液中浸泡2 h，清洗至無味后，使用雙蒸水低滲處理30～60 min;棄雙蒸水，轉入卡諾式固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中于4 ℃冰箱內固定12～20 h;棄固定液，使用75%、90%和100%酒精各脫水5 min，最后轉入70%乙醇溶液中于?20 ℃冰箱內保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? 染色體標本的制備? 染色體標本的制備主要參照高和瓊等[22]和李懋學等[23]的方法，以巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種古銅期嫩葉為材料，取有絲分裂旺盛的葉邊緣進行染色體標本制備，然后將制備好的染色體標本進行下一步熒光原位雜交（FISH）或存放于?20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2? 特異性引物的設計與篩選? 根據MADS- box基因家族中6個基因的登錄號在NCBI上找到目的基因序列，利用NCBI上在線比對軟件BLAST程序進行序列同源性比對，找到序列比對同源性最高的（98%以上）巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種全基因組序列。使用Primer Permier 5設計引物。以橡膠樹基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min，48～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環;72 ℃后延伸7 min。將PCR產物進行凝膠電泳檢測，檢驗產物是否為單一條帶。單一條帶且長度符合的PCR產物測序后用DNAMAN軟件進行多序列比對，判斷是否符合引物的特異性。最后將6個對應基因PCR擴增單一目的條帶產物純化，檢測其濃度，于?20 ℃保存。篩選得到特異性引物見表1。

1.2.3? 探針的制備? 將擴增純化后的6個基因的特異DNA序列中HbAGL8、HbTT16和HbAP1基因用生物素切口平移（BIO-Nick Translation Mix）試劑盒標記成探針，信號位點呈紅色。HbAG15、HbAGL30和HbSVP1基因用地高辛切口平移（DIG-Nick Translation Mix）試劑盒標記成探針，信號位點呈綠色。探針純化后于?20 ℃保存待用。

1.2.4? 熒光原位雜交? 參照官錦燕[24]的方法，并稍作改進，操作如下：首先將染色體形態良好且分散的染色體標本于70 ℃烘箱中恒溫處理2 h左右，起牢化作用，做好標記區分正面;37 ℃下使用10 mg/mL RNA酶溶液處理1 h，減少雜信號影響，使特異信號清晰;在70 ℃預熱后的70%去離子甲酰胺中變性5 min后快速放入預冷的70%、90%和100%酒精各脫水5 min，用冷風吹干;滴加45 μL經變性處理后的雜交液[50%去離子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2×SSC（檸檬酸緩沖液），0.5 mg/mL鮭魚精DNA，20 ng/μL已標記探針]在標本正面中央，蓋上蓋玻片并用指甲油封片后放入雜交儀中，先于90 ℃變性10 min，后于37 ℃孵育16～24 h;孵育結束后用刀片輕輕揭開蓋片，依次在2×SSC溶液中洗滌10 min、20%去離子甲酰胺（42 ℃）靜置10 min、2×SSC溶液中洗滌5 min，1×PBS溶液中洗滌5 min。

級聯熒光信號顯示與放大操作如下：首先滴加50 μL由終濃度為20 μg/mL鼠抗地高辛-Alexa Fluor488、終濃度為10 μg/mL鏈親和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）和1%牛血清白蛋白（中文名稱）配制成的混合液，孵育1 h;然后滴加總體積50 μL的終濃度為20 μg/mL兔抗鼠-Alexa Fluor 488[Alexa Fluor 488-Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgG （H+L）]、終濃度為10 μg/mL生物素化抗鏈親和素（Biotinylated Anti-streptavidin）和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min;再次滴加總體積50 μL的終濃度為20 μg/mL鼠抗兔- Alexa Fluor 488（Alexa Fluor 488-Affinipure Mouse Anti-Rabbit）、終濃度為10 μg/mL鏈親和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）孵育和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min，在每次孵育過后都需經過1×PBS洗滌各3次，洗滌過程均需在水平搖床（WD-9405B型）上中速震蕩洗滌，每次洗滌時間分別是5、5、8 min。最后用40 μL 10 μg/mL的DAPI（抗淬滅劑稀釋）染色，蓋上蓋片并用指甲油封片。實驗過程在避光條件下進行。

1.2.5? 鏡檢與分析? 在雜交后的染色體標本正面滴加適量的鏡油后，用熒光顯微鏡（型號BX51TR-32FA1-A03）觀察，選擇WBV熒光激發塊，用Image-Pro Plus軟件中文版6.0進行拍照保存，第3通道觀察對染色體進行拍照，染色體呈藍色，第2通道觀察生物素標記的雜交位點為紅色，第1通道觀察地高辛標記的雜交位點為綠色，用Photoshop CS6軟件和Adobe Illustrator CS6軟件處理圖片。

依照Song等[25]發布的信號位點百分距計算方法和高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數結合分析，本研究擴增信號位點在染色體上的位置用擴增信號位點到著絲粒的百分距離來衡量。公式如下：

2? 結果與分析

2.1? HbAGL8和HbAGL15基因的FISH檢測與物理定位分析

制作探針時，HbAGL8目的序列用生物素標記，HbAGL15目的序列用地高辛標記，然后進行雙探針熒光原位雜交實驗，以檢測其在染色體上的實際位置。雜交檢測過程中2個基因的信號位點在細胞分裂間期、前期和中期均能同時檢測到，并且紅色和綠色熒光位點明顯分布在不同的染色體上（圖2A、圖2B、圖2C）;陰性對照試驗中，不加入探針進行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測時檢測不到任何熒光信號（圖2D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數為依據，進行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖2E）和核型模式圖（圖5）。結果表明，HbAGL8定位在5號染色體長臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值為39.71;HbAGL15位于4號染色體長臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值11.85。

2.2? HbAGL30和HbTT16基因的FISH檢測與物理定位分析

制作探針時，HbTT16目的序列用生物素標記，HbAGL30目的序列用地高辛標記，進行雙探針熒光原位雜交實驗，檢測其在染色體上的實際位置。雜交檢測過程中2個基因的信號位點在細胞分裂間期、前期和中期均能同時檢測到，并且紅色和綠色熒光位點明顯分布在不同的染色體上（圖3A、圖3B、圖3C）;陰性對照試驗中，不加入探針進行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測時檢測不到任何熒光信號（圖3D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數為依據，進行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖3E）和核型模式圖（圖5）。結果表明：HbTT16定位在1號染色體短臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值為22.19;HbAGL30位于7號染色體長臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值48.94。

2.3? HbAP1和HbSVP1基因的FISH檢測與物理定位分析

制作探針時，HbAP1目的序列用生物素標記，HbSVP1目的序列用地高辛標記，進行雙探針熒光原位雜交實驗，檢測其在染色體上的實際位置。雜交檢測過程中2個基因的信號位點在細胞分裂間期、前期和中期都能同時檢測到，并且紅色和綠色熒光位點明顯分布在不同的染色體上（圖4A、圖4B、圖4C）;陰性對照試驗中，不加入探針進行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測時檢測不到任何熒光信號（圖4D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數為依據，進行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖4E）和核型模式圖（圖5）。結果表明：HbAP1定位在13號染色體短臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值為18.01;HbSVP1位于8號染色體長臂上，信號位點到著絲粒的百分距離平均值6.70。

3? 討論

3.1? 不同功能基因在橡膠樹中的連鎖關系

通過把巴西橡膠樹MADS-box基因家族中的6個成員（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbSVP1和HbAP1）序列用DNAMAN分別兩兩進行序列比對，它們的相似度均在24.48%～ 66.40%之間，這說明它們之間的同源性不高，因此可利用原位雜交技術對這6個MADS-box基因家族成員進行物理定位分析，確定其在染色體上的具體位置。

本研究結果表明，已定位的MADS-box基因家族中的6個成員均位于不同的染色體上，遺傳上可能互為獨立基因的關系（圖5）。結合前人已完成的其他功能基因定位的結果，可以得出：HbAGL15與HbWRKY7[27]、GGPS[28]、HbJAZ1、HbJAZ2[29]、HbCOI1[30]同時位于第4號染色體上;HbAGL8與HblMYC4[31]、HbRZF3[32]、HbNIN1[33]、HbMyb1[34]、HbNAC1[35]同時位于第5號染色體上;HbAGL30與HbWRKY75[27]、HEV1.2[36]、HbPT3[28]、HbRZF4[32]、HbSUT4[24]同時位于第7號染色體上;HbTT16與HbJAZ7[29]、HRT2[28]均位于第1號染色體上;HbAP1與HbWRKY2[27]、HblMYC3[31]、HbJAZ3[29]、SRPP[37]、HEV1.1[36]同時位于第8號染色體上。這些位于同一條染色體上的基因在遺傳上可能互為連鎖基因。

3.2? 在橡膠樹基因組組裝中的輔助作用

隨著全基因組測序工作的不斷推進，中國熱帶農業科學院橡膠研究所于2016年5月完成了巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種的測序工作，并發布了其基因組草圖[38]。但目前只是將contig（重疊群）拼接為大片段的scaffold，而眾多scaffold尚未確定在哪條染色體上，故染色體歸類并不清楚。本研究將MADS-box基因家族中的6個成員HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1基因的序列在NCBI中與巴西橡膠樹‘熱研7-33-97品種的全基因組序列進行比對，這6個成員分別位于全基因組中的scaffold0520、scaffold0451、scaffold2068、scaffold0063、scaffold1741和scaffold0673片段上。根據本研究對MADS-box基因家族中的6個成員定位的結果，可初步判定scaffold0451、scaffold0520、scaffold2068和scaffold0673分別位于第4、5、7和8號染色體長臂上;scaffold0063和scaffold1741分別位于第1和13號染色體短臂上。因此，本研究結果可為橡膠樹基因組scaffold序列的染色體歸屬提供分子細胞遺傳學依據。

3.3? 對比分子標記基因定位的優勢

用現有分子標記也能進行基因定位，關鍵環節包括：（1）根據遺傳材料之間的多態性確定親本組合，建立作圖群體;（2）群體中不同植株的標記基因型的分析;（3）標記間連鎖群的確定。其中構建分離群體是作圖成功的關鍵[39]。選擇合適的分子標記對群體中所有個體進行基因型分析，通過親代與子代表現型的分離比例，可以判定基因與標記基因的連鎖關系，從而確定基因與連鎖群的連鎖關系，其他功能基因也需要使用同樣方法才能確定與連鎖群的連鎖關系，才能得知不同基因間的連鎖關系，需要耗費大量的時間、人力和物力。但通過物理定位僅需將染色體標本通過FISH的方式，確定基因在染色體上的真實位置，通過其位置關系來初步推測它們的遺傳關系，初步判斷它們是否存在連鎖，以及它們與其他已定位基因的連鎖關系，更快更容易就能知道這些基因的遺傳關系。

本研究所揭示的MADS-box基因家族中的6個基因分別在細胞核染色體上的物理位置，以及它們與其他已定位基因之間的位置關系，有助于進一步了解這些基因間可能的遺傳關系，彌補了MADS-box基因家族分子細胞遺傳學信息的空白，可為該基因家族在橡膠樹分子調控機理的研究提供細胞核位置信息，從而為橡膠樹分子輔助育種提供有力的科學依據。

參考文獻

Passmore S， Maine G T， Elble R， et al. Saccharomyces cerevisiae protein involved in plasmid maintenance is necessary for mating of MATα cells[J]. Journal of Molecular Biology， 1988， 204（3）： 593-606.

Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors[J]. Nature， 1990， 346（6279）： 35-39.

Huijser P. Deficiens， a homeotic gene involved in the control of flower morphogenesis in Antirrhinum majus： The protein shows homology to transcription factors[J]. EMBO Journal， 1990， 9（3）： 605-613.

Norman C， Runswick M， Pollock R， et al. Isolation and properties of cDNA clones encoding SRF， a transcription factor that binds to the c-fos serum response element[J]. Cell， 1988， 55（6）： 989-1003.

黃? 方， 遲英俊， 喻德躍. 植物MADS-box基因研究進展[J]. 南京農業大學學報， 2012， 35（5）： 9-18.

楊貞妮. 番茄MADS-box基因TAGL104的克隆及功能研究[D]. 重慶： 重慶大學， 2017.

宗成文， 房經貴， 陶建敏， 等. 葡萄MADS-box家族基因保守片段的克隆與序列分析[J]. 果樹學報， 2008， 25（1）： 27-32.

王? 婧. 荷花MADS-box基因的克隆及表達分析[J]. 江蘇農業科學， 2017， 45（1）： 39-42.

Khattak B. 小麥MADS-Box基因家族全基因組分析[D]. 北京： 中國農業科學院， 2017.

Mandel M A， Yanofsky M F. The Arabidopsis AGL9 MADS-box gene is expressed in young flower primordia[J]. Sex Plant Reprod， 1998， 11（1）： 22-28.

Alvarez-Buylla E R. MADS-box gene evolution beyond flowers： Expression in pollen， endosperm， guard cells， roots and trichomes[J]. The Plant Journal， 2000， 24（4）： 457-466.

Weigel D， Nilsson O. A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants[J]. Nature， 1995， 377 （6549）： 495-500.

Seung Kwan Yoo， Jong Seob Lee， Ji Hoon Ahn. Overexpression of AGAMOUS-LIKE 28 （AGL28） promotes flowering by upregulating expression of floral promoters within the autonomous pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication， 2006， 348（3）： 929-936.

Adamczyk B J， Fernandez D E. MIKC* MADS domain heterodimers are required for pollen maturation and tube growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2009， 149（4）： 1713-1723.

Buchner P， Boutin J P. A MADS-box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 38（6）： 1253-1255.

Gu Q， C Ferrándiz， Yanofsky M F， et al. The FRUITFULL MADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development[J]. Development， 1998， 125（8）： 1509-1517.

Dornelas M C. Martinelli R A P. The rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.） homologue of the LEAFY/ FLORICAULA gene is preferentially expressed in both male and female floral meristems[J]. Journal of Experimental Botany， 2005， 56（417）： 1965-1974.

華玉偉， 孫? 芳， 黃天帶， 等. 橡膠樹HbFCA啟動子的克隆及其在橡膠樹中的表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（5）： 800-806.

王? 輝， 李? 琳， 梁? 正， 等. 巴西橡膠樹MADS-27基因的克隆與生物信息學分析[J]. 熱帶農業科學， 2013， 33（12）： 19-24.

魏利然， 李輝亮， 郭? 冬， 等. 巴西橡膠樹HbMADS4的克隆及原核表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（5）： 888-894.

王亞杰. 巴西橡膠樹MADS-box基因家族的克隆、表達譜分析及功能驗證[D]. 海口： 海南大學， 2017.

高和瓊， 王? 英， 金? 鴿， 等. 橡膠樹葉片染色體制片方法的優化[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（5）： 565-569.

李懋學， 張敩方. 植物染色體研究技術[M]. 哈爾濱： 東北林業大學出版社， 1991.

官錦燕. 巴西橡膠樹SUT和RZF基因家族物理定位的研究[D]. 海口： 海南大學， 2014.

Song Y C， Gustafson J P. The physical location of fourteen RFLP markers in rice （Oryza sativa L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1995， 90（1）： 113-119.

高和瓊， 莊南生， 王? 英， 等. 橡膠樹兩個品種的核型分析[J]. 武漢植物學研究， 2009， 27（5）： 537-540.

劉正林， 莊南生， 王? 英， 等. 巴西橡膠樹HbWRKY基因家族10個成員在染色體上的定位[J]. 植物遺傳資源學報， 2018， 19（6）： 1170-1179.

張新新. 巴西橡膠樹4個膠乳生物合成相關基因的物理定位研究[D]. 海口： 海南大學， 2013.

李曉燕， 蘇莉莉， 高佳佳， 等. JAZ基因家族6個成員在橡膠樹上的物理定位[J]. 分子植物育種， 2017， 15（12）： 4992-4999.

高佳佳. 巴西橡膠樹幾個與橡膠合成相關基因的物理定位研究[D]. 海口： 海南大學， 2014.

高? 豫， 莊南生， 王? 英， 等. MYC基因家族5成員在巴西橡膠樹染色體上的物理定位[J]. 熱帶生物學報， 2018， 9（2）： 163-169.

官錦燕， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹4個環鋅指蛋白基因（HbRZF）的物理定位[J]. 基因組學與應用生物學， 2014， 33（3）： 610-616.

高佳佳， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹膠乳轉化酶HbNIN基因家族物理定位的研究[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（9）： 1704-1709.

高和瓊. 巴西橡膠樹HbMyb1基因和OPV-10_（390）連鎖標記原位PCR定位的研究[D]. 海口： 海南大學， 2008.

楊光涌， 鄭? 菲， 王? 英， 等. 巴西橡膠樹NAC基因家族5個成員的熒光原位雜交物理定位[J]. 分子植物育種， 2018， 16（2）： 512-517.

彭寶豐， 王? 英， 高和瓊， 等. 橡膠素基因家族4個成員在橡膠樹染色體上的定位[J]. 熱帶生物學報， 2016， 7（3）： 318-324.

官錦燕. 巴西橡膠樹SUT和RZF基因家族物理定位的研究[D]. 海口： 海南大學， 2014.

Tang C R， Yang M， Fang Y J， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16073.

趙淑清， 武維華. DNA分子標記和基因定位[J]. 生物技術通報， 2000（6）： 1-4.