T7噬菌體穿孔素的克隆表達及對宿主損傷研究

徐海 鮑熹 董洪燕 郭長明 鄧碧華 盧宇 朱善元

摘要：為研究T7噬菌體穿孔素（Holin）蛋白對宿主細菌的增殖性能的影響，根據T7噬菌體gene 17.5設計引物，PCR擴增Holin基因和序列分析，將該基因插入原核表達載體構建重組表達菌BL-Holin。IPTG誘導Holin蛋白表達，SDS-PAGE和Western-blot檢測目標蛋白。分光光度法測定Holin蛋白對宿主細菌增殖性能的影響，掃描電鏡觀察重組菌誘導后表面結構的損傷情況。結果表明，成功擴增Holin基因，構建的重組菌能高效表達Holin蛋白。T7噬菌體Holin蛋白含有1個跨膜區，氨基端位于胞外、羧基端位于胞內。Holin蛋白的表達量隨誘導時間延長而逐漸增加，細菌濃度從誘導0 h至2 h逐漸升高，2 h后細菌濃度開始下降，直至6 h，電鏡觀察發現誘導細菌表面塌陷、皺縮進而死亡。研究結果顯示，Holin蛋白具有抑菌活性，這為進一步開發噬菌體抗菌制劑提供應用基礎和技術支持。

關鍵詞：穿孔素;表達;宿主損傷;T7噬菌體

中圖分類號： S188 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0045-04

噬菌體是分子生物學起源與發展的模式生物，在發現之初就被用于細菌感染性疾病的治療，隨著人類進入抗生素時代使得噬菌體逐漸淡出人們的視野。近年來，細菌的耐藥性已然成為全球范圍內的公共健康問題，每年有近百萬因耐藥菌感染引起的死亡病例，面對這一嚴峻問題，人們開始尋找新的抗菌產品，這其中噬菌體作為細菌的天然殺手再次受到研究人員的關注[1-2]。然而，利用噬菌體防控細菌感染也面臨一個棘手問題，噬菌體宿主識別譜窄，一種噬菌體往往只侵染一種或一類細菌，這限制了噬菌體在抗菌領域推廣與應用[3]。烈性噬菌體裂解系統中的溶菌酶、穿孔素等蛋白作用于細菌的細胞壁、細胞膜，引起細菌裂解，效率高且不受宿主譜的限制，對細菌具有廣譜的裂解活性，已成為開發新型抗菌制劑的熱點之一[4-6]。

烈性噬菌體裂解宿主細菌的過程有著緊密的調控、遵循著嚴格的時間順序[7-9]。溶菌酶-穿孔素二元裂解模型的提出對這一過程給予系統的解析。穿孔素是控制裂解時間的小分子量疏水性跨膜蛋白，在特定時間以寡聚體形式聚集于細胞內膜上并形成穩定的跨膜孔道，是噬菌體啟動裂解步驟的“定時器”[10-12]。溶菌酶是一種胞質水解酶，隨著孔道的打開，溶菌酶被釋放到胞外，對肽聚糖層進行高效的切割[13-14]。近年來發現的Spanin蛋白對二元裂解模型做了進一步完善，該蛋白定位在細菌外膜，通過構象變化破壞細菌外膜結構[15-16]。在溶菌酶、穿孔素和Spanin的共同作用下，被侵染細菌徹底崩解。因此，研究上述3種蛋白與宿主細菌的作用關系，探明各自對宿主的損傷機制，才能更科學地加以利用。

T7噬菌體是侵染大腸桿菌的小型烈性噬菌體，具有良好的生長性能，侵染宿主細菌1～2 h即能完全裂解。對T7噬菌體的生物學背景已有相對全面的研究，其全部基因序列己經測定，是噬菌體研究的理想模型。本研究通過原核系統表達T7噬菌體穿孔素蛋白，分析其結構特征，揭示該蛋白對宿主的損傷作用，并測定其抑菌活性，以期為新型抗菌制劑的開發提供有益探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

質粒、菌株與噬菌體：質粒pET-28a（+）為筆者所在實驗室保存。大腸桿菌BL21-DE3、T7 select 415-1b噬菌體購自Merck公司。

主要試劑：限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、反轉錄酶為大連寶生物公司產品;HRP標記抗His標簽二抗購自Abcom公司;引物由金斯瑞生物公司合成，引物序列為：Holin-F：5′-ATACCATGGGCGTGCTATCATTAGACT-3′，Holin-R：5′-AGACTCGAGTCACTCCTTATTGGCT-3′，引入中下劃線分別表示限制酶切位點（NcoⅠ和 BamHⅠ）;其余試劑均為分析純。

1.2 Holin基因分析

將Holin基因翻譯成對應蛋白序列，利用在線分析工具TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）對其進行跨膜區預測;在Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org）進行比對，分析Holin蛋白所屬的家族;Protparam工具（https：//web.expasy.org/protparam）分析蛋白的理化性質;SOPMA工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對蛋白質二級結構進行分析。

1.3 重組菌構建

以T7 select415-1b噬菌體基因組為模板，PCR擴增Holin基因。根據預設的酶切位點將基因片段插入原核表達載體pET-28a（+），構建重組表達質粒pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定及測序分析。將序列正確的重組表達質粒化學轉化導入大腸桿菌BL21-DE3感受態細胞，篩選表達Holin蛋白的重組菌BL-Holin。

1.4 Holin蛋白誘導表達與鑒定

挑取單菌落BL-Holin接入含有1 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，37 ℃搖床過夜培養。取 50 μL 過夜培養菌液至5 mL新鮮卡那霉素抗性LB培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養2 h，加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導。同時，設BL21和BL-Holin未誘導對照。從誘導起始點開始，每隔2 h取樣，經12% SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。轉印蛋白至NC膜，用HRP標記的羊抗His tag二抗鑒定Holin蛋白。

1.5 Holin蛋白表達對宿主菌增殖的影響

以1 ∶ 100比例轉接過夜培養的BL21、BL-Holin至新鮮培養基，在對數生長前期往重組菌 BL-Holin 中加入工作濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導，同時設BL21和未誘導對照組，于37 ℃、200 r/s搖床持續培養。從轉接起始點開始每隔1 h取200 μL培養液測定D600 nm，繪制3組細菌的生長曲線。

1.6 Holin蛋白表達對宿主菌表面結構的影響

以1 ∶ 100比例轉接過夜培養的BL-Holin重組菌，在對數生長前期加入IPTG進行誘導，持續誘導3 h，同時設未誘導對照。5 000 r/min，10 min收集重組菌，PBS重懸洗滌1次，再次離心后收集沉淀，采用4%多聚甲醛固定。樣品送至揚州大學檢測中心，掃面電鏡觀察細菌表面結構。

2 結果

2.1 Holin蛋白序列分析

利用多種生物學軟件對T7噬菌體Holin蛋白進行分析：Protparam工具顯示T7噬菌體Holin蛋白由67個氨基酸組成，相對分子質量為7 359，穩定系數為7.71，總平均親水性為0.464，為穩定、疏水性蛋白質。Pfam數據庫比對結果表面T7噬菌體Holin蛋白屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746）。TMHMM軟件分析表明其氨基酸端1～36 aa位于胞外區，37～55 aa為跨膜區，56～67 aa的羧基端為胞內區。SOPMA工具顯示，holin蛋白。α-螺旋、β-折疊、β-轉角、延長鏈、和無規則卷曲分別占氨基酸總數的56.72%、0.00%、7.46%、10.45%和2537%（圖1）。

2.2 Holin基因的克隆及重組質粒構建

由圖2-A和2-B可知，以T7噬菌體基因為模板，PCR擴增出約250 bp的Holin基因，測序結果表明獲得基因片段序列正確。將該基因片段插入pET-28a（+）載體，成功構建重組表達質粒載體pET-Holin，NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定正確。

2.3 Holin蛋白誘導表達及鑒定

由圖3-A可知，對數生長前期的重組菌BL-Holin經IPTG誘導后細菌濃度并未迅速上升，相反隨著誘導時間的延長，重組菌出現裂解現象，培養液變清亮且泡沫增多。由圖3-B可知，SDS-PAGE檢測誘導菌有蛋白表達。由圖3-C可知，利用Holin蛋白羧基端融合表達的His標簽進行Western-blot檢測，進一步確定誘導產生Holin蛋白，并且隨著誘導時間的延長Holin蛋白的累積量逐漸增加。

2.4 Holin蛋白的表達對宿主細菌增殖的影響

IPTG誘導重組大腸桿菌BL-Holin表達Holin蛋白，通過對重組表達菌不同時間點的濁度測定來評價Holin蛋白對宿主細菌增殖能力的影響，由圖4可知，BL-Holin轉接后2 h開始誘導，細菌濁度緩慢上升至4 h，然后濁度逐漸下降，6～8 h濁度維持在較低水平，8 h后濁度開始緩慢上升。而未經誘導的BL-Holin表現出與BL21相似的增殖性能，表明Holin蛋白的表達抑制宿主的正常增殖。

2.5 Holin蛋白對宿主細菌表面結構的損傷

通過掃面電鏡觀察經IPTG誘導和未誘導的BL-Holin 重組菌表面結構變化，評價Holin蛋白對宿主的損傷情況。由圖5-B可知，誘導表達Holin蛋白的重組菌表面塌陷，菌體皺縮，而未誘導的重組菌保持完整的表面結構（圖5-A）。由此可知，重組菌表達Holin蛋白后造成胞膜的損傷，其結構完整性被破壞致使內容物釋放到胞外，引起菌體死亡。

3 討論

上世紀40年代開始，噬菌體研究進入早期的黃金時代，以λ噬菌體和T4噬菌體作為模式生物的相關研究為現代分子生物學的建立作出了卓越貢獻。Young于1992年首次提出了著名的穿孔素-溶菌酶二元裂解系統理論，清晰地闡明了λ噬菌體裂解宿主的過程[17]。當然，這一理論將肽聚糖層的破壞作為裂解宿主菌的主要標志，卻忽視了細菌外膜對裂解過程的阻礙。近年來，第三類裂解相關蛋白Spanin的發現進一步完善了該理論，至此λ噬菌體裂解宿主的過程可分為3個步驟：Holin蛋白在細菌內膜打孔，釋放胞內溶菌酶切割肽聚糖層，Spanin通過構象變化撕裂細菌外膜，最終導致細菌的徹底崩解。參與這一過程的穿孔素、溶菌酶和Spanin均能造成細菌表面結構的損傷，因此被視為開發新型抗菌制劑的候選物質而備受關注。

T7噬菌體裂解系統研究報道較少，現已明確溶菌酶（gene3.5）、穿孔素（gene17.5）以及可能發揮Spanin功能的gene18.5/18.7構成了T7噬菌體裂解系統[15，18]。本研究對T7噬菌體Holin蛋白進行序列分析，發現該蛋白分子僅有1個跨膜區，屬于Phage_holin_2_2家族（PF10746），氨基酸端位于胞外，羧基端位于胞內，這與報道的T4、T5噬菌體的Holin蛋白拓撲結構相同。為了不影響T7噬菌體Holin蛋白的跨膜轉運，選擇位于胞內的羧基端融合表達His標簽用于Western-blot檢測。結合圖3-C和圖4，重組菌誘導后2 h內Holin蛋白處于積累階段，此時細菌濃度緩慢上升，當Holin蛋白量積累到一定閾值后造成細菌膜結構損傷，此時細菌濃度逐漸下降并維持在較低水平。繼續誘導后期至8 h，此時Holin蛋白積累量仍然增加，而細菌濃度也逐步增加，對于這一現象尚需要進一步研究分析。由圖5可見，Holin蛋白在細菌內膜聚集并形成孔道，由于缺少溶菌酶的釋放，并不會對胞外結構造成直接破壞，但此時胞內可溶性蛋白、電解質等可通過孔道流失，菌體呈現塌陷、皺縮狀態，最終死亡。

作為噬菌體裂解系統，穿孔素、溶菌酶無論單獨使用還是聯合使用，均能起到有效抑制細菌增殖的作用[19]。穿孔素還可以作為轉運載體，輔助藥物、核酸、蛋白質進入菌體內部，進一步提高抗菌效率[20-21]。此外，噬菌體在入侵宿主時需要在菌體表面開孔注入核酸物質，例如T7噬菌體的gp16能夠水解細胞壁啟動感染，這類蛋白也可以用作抗菌制劑的開發[22]。本研究對T7噬菌體的穿孔素進行原核表達，分析該蛋白的結構、評價其抑菌活性，并初步解析其損傷細菌膜結構的機制，這可為進一步研究穿孔素的抑菌機制以及開發利用穿孔素的抗菌活性做出有益的探索。

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