再生醫(yī)學(xué)在糖尿病下肢動脈病變的研究進(jìn)展

畢藝鳴 林玉平 范冠杰 殷 貝 李安香 黃錦珠 王獻(xiàn)哲

糖尿病是一種威脅公共衛(wèi)生安全的慢性代謝性疾病，下肢動脈病變(lower extremity arterial disease，LEAD)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，其臨床病理主要表現(xiàn)為一條或多條下肢動脈部分堵塞或完全堵塞，臨床癥狀為肢體功能障礙，出現(xiàn)間歇性跛行、靜息痛、麻木、冷沉重感、潰瘍和壞疽等。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，全球下肢動脈病變患者已經(jīng)達(dá)到2.02億，雖然糖尿病患者中LEAD的確切患病率難以估算，但許多研究已證實(shí)，糖尿病是下肢動脈病變的獨(dú)立危險因素，糖尿病LEAD的發(fā)生率是普通人群的2～4倍[1]。與非糖尿病患者比較，糖尿病合并LEAD疾病病情更復(fù)雜、進(jìn)展更迅速，更容易影響遠(yuǎn)端肢體動脈，并成為糖尿病足發(fā)病的誘因，與糖尿病患者致殘、致死密切相關(guān)。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，目前糖尿病合并LEAD的治療手段不斷增加，除內(nèi)科藥物治療、外科血運(yùn)重建治療外，再生醫(yī)學(xué)如干細(xì)胞治療以及基因治療等新型療法的提出，為糖尿病合并LEAD的防治提供了新的方向與思路。現(xiàn)就再生醫(yī)學(xué)在糖尿病合并LEAD的治療現(xiàn)狀及前景進(jìn)行綜述。

一、再生醫(yī)學(xué)的概念及發(fā)展應(yīng)用

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，“再生”的概念誕生于20世紀(jì)50年代，在動物模型中進(jìn)行的首次骨髓移植實(shí)驗(yàn)中，該實(shí)驗(yàn)為人類干細(xì)胞治療疾病帶來了曙光，并由此衍生出多類與“再生”相關(guān)的分支學(xué)科。近年來，隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入，一系列新興技術(shù)如基因編輯技術(shù)、細(xì)胞測序技術(shù)、生物信息技術(shù)以及高通量組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，極大地豐富了再生醫(yī)學(xué)的研究范疇，使再生醫(yī)學(xué)不僅成為了解基礎(chǔ)生物學(xué)和疾病發(fā)病機(jī)制的研究手段之一，同時也為再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前，再生醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為一門綜合生命科學(xué)、生物材料科學(xué)、組織工程學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)等的科學(xué)，旨在通過利用干細(xì)胞和(或)祖細(xì)胞的潛能，刺激受損機(jī)體的修復(fù)機(jī)制，從而恢復(fù)身體組織或器官的功能，實(shí)現(xiàn)治療疾病的作用[2]。再生醫(yī)學(xué)療法可分為干細(xì)胞和組織工程兩大重要分支，其中細(xì)胞工程又分為基因治療以及細(xì)胞移植治療，這些療法不僅在皮膚科、燒傷科及骨科等外傷疾病中應(yīng)用廣泛，也在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌代謝疾病等領(lǐng)域取得了一定的研究成果，展示出再生醫(yī)學(xué)廣闊的發(fā)展應(yīng)用空間[3～5]。

二、再生醫(yī)學(xué)在糖尿病下肢動脈病變的優(yōu)勢及局限

預(yù)防缺血，改善肢體供血以及恢復(fù)肢體功能狀態(tài)是糖尿病LEAD治療的主要目的，如何使血管功能恢復(fù)成為治療糖尿病LEAD的重點(diǎn)，大約在20年前，“治療性血管生成”的概念誕生，該概念被定義為在生長因子的刺激下，從原有的血管中生長出新的血管，是一種治療臨床疾病的手段。在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，血管再生可通過細(xì)胞工程得以實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞療法主要包括基因療法和干細(xì)胞移植，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有研究者對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，或與其他生長因子等聯(lián)合運(yùn)用治療糖尿病下肢血管病變，并表現(xiàn)出各自的優(yōu)越性及局限性。

1.基因療法治療糖尿病LEAD：基因療法是生命科學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)結(jié)合而誕生的新興療法，通過改變甚至改造基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。多種生長因子如管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth f actor，VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)已經(jīng)被證實(shí)是血管生成信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，隨著年齡增長，內(nèi)源性生長因子生成和分泌減少，可能是導(dǎo)致一系列疾病出現(xiàn)的誘因。已經(jīng)有研究報(bào)道認(rèn)為，某些生長因子的分泌水平與糖尿病LEAD的發(fā)展有關(guān)[6]。Solovyeva等[7]利用VEGF及SDF-1的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染人臍靜脈源性內(nèi)皮細(xì)胞，可刺激毛細(xì)血管袢的形成；Guo等[8]利用VEGF及SDF-1腺病毒載體轉(zhuǎn)染腦梗死大鼠4周后，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)VEGF及SDF-1的表達(dá)上調(diào)，免疫熒光結(jié)果提示梗死病灶微循環(huán)改善，血管生成增加；Iris等[9]對6例即將截肢的患者進(jìn)行多次FGF-1表達(dá)載體肌內(nèi)注射，在數(shù)天后，對截肢后的肌肉進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)高度表達(dá)FGF基因及其受體，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說明這些內(nèi)源性生長因子通過基因編輯均可用于治療缺血性疾病。有研究者通過基因誘導(dǎo)的血管生成方法對65例糖尿病下肢動脈病變患者進(jìn)行治療，隨訪6個月后，接受基因治療的患者TcPO2以及PFWD明顯改善；隨訪1年后，截肢率及致死并發(fā)癥發(fā)生率顯著下降[10]。然而，另外有研究者對280例糖尿病下肢動脈缺血患者進(jìn)行隨機(jī)對照研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因治療雖然具有降低ABI的趨勢，但與治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時基因治療并不能使截肢率和病死率下降[11]。最近一項(xiàng)Meta分析結(jié)果也表明，F(xiàn)GF、HGF及VEGF等生長因子并不能降低大面積截肢率及LEAD致死率，但可能會改善糖尿病LEAD患者血流動力學(xué)狀態(tài)，降低輕度截肢的風(fēng)險[12]。以上臨床試驗(yàn)說明生長因子基因治療似乎是安全的，但其有效性仍未明確；其次，由于生長因子屬于生物高分子，其自身穩(wěn)定性差，半衰期短，通常需要多次給藥以維持治療效果，因此，真正要將生長因子基因療法應(yīng)用到臨床治療仍存在很大障礙。

2.干細(xì)胞移植治療糖尿病LEAD：干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始細(xì)胞，是人體內(nèi)各種組織器官形成的基石，醫(yī)學(xué)界將其稱為“萬用細(xì)胞”。根據(jù)不同發(fā)育階段，干細(xì)胞可分為胚胎和成體干細(xì)胞。在出生后和成年階段，內(nèi)源性成體干細(xì)胞在生理應(yīng)激、缺氧、炎癥等多種情況下可從來源組織向外周血液動員，并在器官損傷后的修復(fù)中發(fā)揮作用。根據(jù)供體的不同，干細(xì)胞移植療法又分為自體移植和異體移植。細(xì)胞類型可包括骨髓單核細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、外周血干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞等。這類細(xì)胞在促進(jìn)組織再生、保護(hù)缺血組織、調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫方面具有顯著潛能[3]。許多動物研究也顯示，干細(xì)胞不僅具有分化為血管的潛能，還具有旁分泌功能，通過分泌各種生長因子如血基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)及胰島素樣生長因子等(insulin-like growth factors，IGF-1)，抑制細(xì)胞死亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮遷移增殖，激活缺血組織中的干細(xì)胞/祖細(xì)胞，并為缺血病灶募集額外的干細(xì)胞/祖細(xì)胞，參與血管新生的全過程，增加糖尿病缺血下肢的血流量，改善肢體缺氧狀態(tài)以及修復(fù)肌肉損傷[13, 14]。

一項(xiàng)涉及1186例患者的自體干細(xì)胞移植治療下肢動脈病變的Meta分析結(jié)果顯示，自體干細(xì)胞移植在改善踝臂指數(shù) (ankle-brachial index, ABI)，經(jīng)皮氧氣張力(transcutaneous oxygen pressure, TcPO2)，無痛步行距離(pain-free walking distance，PFWD)等方面具有顯著療效，并可降低糖尿病患者的截肢率及提高下肢潰瘍的愈合率[15]。但研究顯示，不同類型的自體干細(xì)胞可能具有不同的治療效果，有研究者對28例糖尿病下肢動脈病變的患者進(jìn)行自體骨髓源性單核細(xì)胞或外周血干細(xì)胞移植治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞移植6個月后，接受移植患者TcPO2顯著改善，截肢率下降，且無全身性血管生成等不良反應(yīng)出現(xiàn)，骨髓源性單核細(xì)胞移植及外周血干細(xì)胞移植在改善肢體缺血方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16]。有研究者對自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及骨髓源性單核細(xì)胞移植治療糖尿病下肢血管病變的遠(yuǎn)期療效進(jìn)行了比較，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在降低截肢率以及減少足部感染方面有一定優(yōu)勢，隨訪3年后發(fā)現(xiàn)自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可有效地降低肢體缺血及足部潰瘍的復(fù)發(fā)率，延長肢體搶救時間以及改善血流，這說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在自體干細(xì)胞移植治療糖尿病LEAD中的潛在優(yōu)勢[17]。由于臨床中大部分糖尿病LEAD患者屬于高齡，身體狀態(tài)較差，多次采集自體干細(xì)胞使患者面臨感染、組織壞死等的風(fēng)險，自體干細(xì)胞質(zhì)量差，其向血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化能力低，促血管生成活性低，抗血管生成因子活性增高，并有可能使患者面臨血栓形成的危險，這均限制了自體干細(xì)胞移植的應(yīng)用。

因此，有研究者提出了異體干細(xì)胞移植。雖然異體干細(xì)胞移植具有加重炎性反應(yīng)，誘發(fā)受者體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的風(fēng)險。但一項(xiàng)Meta分析結(jié)果表明，異體干細(xì)胞移植安全且有效，療效與自體干細(xì)胞移植相當(dāng)[18]。而脂肪干細(xì)胞取材廣泛，活性較高，已經(jīng)成為細(xì)胞療法的重要研究對象之一。在一項(xiàng)前瞻性臨床研究中，15例嚴(yán)重肢體缺血的患者經(jīng)過多次脂肪干細(xì)胞肌內(nèi)注射后，66.7%的患者出現(xiàn)臨床癥狀緩解，在經(jīng)過平均6個月的隨訪期后，所有患者疼痛等級量表以及PFWD均有所改善，治療前后的血管造影提示，所有患者均形成新的血管側(cè)支網(wǎng)絡(luò)[19]。臍帶血、胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性低，分化潛能高，同樣在異體移植的研究中成為熱點(diǎn)。有研究以胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對4例糖尿病LEAD患者進(jìn)行肌內(nèi)注射，并分別在治療后第0、4、12、24周對糖尿病LEAD患者臨床癥狀，血流動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4例患者臨床缺血特征在隨訪12周后均得到改善，24周后明顯好轉(zhuǎn)，PFWD顯著延長，同時1例患者下肢血管MRA提示側(cè)支動脈形成，2例患者下肢潰瘍愈合；所有患者在隨訪12周后出現(xiàn)TNF-α下降，這初步提示了胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞具有治療糖尿病LEAD患者的作用，并具有改善糖尿病炎癥狀態(tài)的能力。有研究報(bào)道認(rèn)為，來源于胎盤的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性及促血管生成活性均優(yōu)于脂肪干細(xì)胞及骨髓干細(xì)胞，無論其分離成功率如何，體外增殖的胎盤干細(xì)胞仍可用于移植，且“保質(zhì)期”更長，胎盤源性間充質(zhì)干細(xì)胞可能是異體移植治療糖尿病LEAD的首選。然而，異體干細(xì)胞移植治療糖尿病LEAD相關(guān)的臨床研究較少，因此該結(jié)論仍需要進(jìn)一步證實(shí)。

3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞療法聯(lián)合治療糖尿病LEAD：與基因療法比較，干細(xì)胞移植在臨床上的應(yīng)用可能更為成熟，但越來越多研究認(rèn)為，高血糖環(huán)境以及與糖尿病有關(guān)的其他代謝異常可能影響移植干細(xì)胞的特性[20]。為了使干細(xì)胞促血管生成的特性在糖尿病患者體內(nèi)得到更好地發(fā)揮，有研究者提出以干細(xì)胞為載體，進(jìn)行生長因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，聯(lián)合應(yīng)用于糖尿病LEAD的治療中。Xiaoling等[21]通過糖尿病大鼠下肢缺血模型探討VEGF過表達(dá)的臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞的治療作用，結(jié)果表明，與VEGF正常表達(dá)的臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞比較，VEGF過表達(dá)的干細(xì)胞增殖活性增加，在移植后4周VEGF表達(dá)達(dá)到峰值，掃描式激光多普勒及CTA均顯示血流量增加，血管生成增加，這可能與一系列促血管新生信號通路如ERK、AKT等的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。而將轉(zhuǎn)染IGF基因的人胎盤源性間充質(zhì)干細(xì)胞移植到糖尿病小鼠缺血后肢，可提高該細(xì)胞存活率并促進(jìn)血管生成，同時可有效減少組織纖維化[22]。隨后，Skóra等[23]以VEGF質(zhì)粒表達(dá)載體導(dǎo)入骨髓單核細(xì)胞，對16例糖尿病下肢動脈病變患者進(jìn)行臨床試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后2周VEGF表達(dá)顯著增加，治療后3個月，所有患者ABI顯著提高，間歇性破行癥狀改善，12例患者CTA提示側(cè)支血管發(fā)育。

此外，體細(xì)胞還可通過基因編輯，獲得與人胚胎干細(xì)胞相似的特性，此類體細(xì)胞被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。雖然iPSCs在形態(tài)、增殖、基因表達(dá)等方面與人體干細(xì)胞相似，但目前尚不明確其與人體干細(xì)胞在臨床實(shí)踐中差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，目前僅有動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，iPSCs可通過調(diào)控外泌體的分泌促進(jìn)小鼠血管新生，減輕肢體缺血[24]。另外，由于iPSCs的誕生應(yīng)用了反轉(zhuǎn)錄病毒載體及c-myc等癌基因，將該細(xì)胞應(yīng)用于人體可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，這使iPSCs在臨床應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑[5]。目前關(guān)于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞治療糖尿病LEAD的臨床研究仍較少，但這無疑為糖尿病LEAD的治療提供了一個新的思路與方向。

三、展 望

糖尿病LEAD病變范圍廣，是多系統(tǒng)病變的結(jié)果，目前臨床上以綜合治療為主。但部分臨床研究結(jié)果提示，強(qiáng)化降糖、降壓、調(diào)脂以及抗血小板治療能改善糖尿病LEAD患者心血管預(yù)后，卻不能延緩LEAD的發(fā)展，更不能降低LEAD患者下肢不良事件的發(fā)生率。盡管外科血運(yùn)重建治療是重癥LEAD的首選方法，但糖尿病患者傷口愈合不全以及嚴(yán)重截肢的風(fēng)險更高，住院時間更長，再次入院率也較高。此外，有部分重癥糖尿病LEAD患者在保守治療無效的情況下，也不適合進(jìn)行外科治療。在這種情況下，基因療法、干細(xì)胞移植等再生療法的應(yīng)用，為糖尿病LEAD的治療帶來了新的選擇。而作為再生醫(yī)學(xué)的重要分支，目前以上療法已經(jīng)從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)過渡到臨床研究階段，并展示出各自不同的臨床應(yīng)用前景。基因療法將生長因子裝配于特定載體，直接導(dǎo)入缺血部位，該療法操作簡便，容易推廣，但存在療效持續(xù)時間短、療效不穩(wěn)定等問題，因此尚不能應(yīng)用于臨床。

與基因療法比較，采用干細(xì)胞移植治療糖尿病LEAD的療效更確切，而間充質(zhì)干細(xì)胞具有來源豐富、分化潛能高、細(xì)胞活力較強(qiáng)、免疫源性較低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為了干細(xì)胞治療的主要細(xì)胞類型，但干細(xì)胞提取、分離、純化等程序復(fù)雜，技術(shù)要求高，對移植受者及供者的身體健康條件有一定要求，在臨床中不易推廣應(yīng)用。而隨著對再生醫(yī)學(xué)的深入研究，糖尿病LEAD再生療法的研究已經(jīng)從單技術(shù)、單方法逐漸發(fā)展到多技術(shù)、多途徑聯(lián)合應(yīng)用，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞的出現(xiàn)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誕生擴(kuò)大了細(xì)胞治療的應(yīng)用前景，使得干細(xì)胞取材來源更豐富的同時，提高了干細(xì)胞活性，實(shí)現(xiàn)了生長因子的持續(xù)表達(dá)，減少了倫理爭議。尤其是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用還從一定程度上簡化了干細(xì)胞移植的步驟，雖然目前其治療糖尿病LEAD的機(jī)制尚不明確，臨床研究數(shù)據(jù)不充分，相關(guān)研究仍停留在動物實(shí)驗(yàn)層面，但其出現(xiàn)無疑開創(chuàng)了糖尿病LEAD再生治療的新篇章，將成為未來血管再生臨床應(yīng)用的重點(diǎn)研究方向。