腸易激綜合征患者腸道菌群特征及其與腸黏膜肥大細胞活化的關系

柯少雄，楊長青，陳俊杰，盛淑婷，魏子白

長治醫學院附屬和平醫院，山西長治046000

腸易激綜合征(IBS)是最常見的功能性胃腸道疾病之一，發病機制尚不明確，但目前認為腸道菌群紊亂和免疫炎癥因素在IBS的發病機制中起重要作用[1]。許多研究表明，IBS患者存在腸道菌群紊亂[2,3]，但至今尚未完全闡明腸道菌群紊亂在IBS中的作用機制。另有研究表明，肥大細胞(MC)的浸潤及活化在腸道慢性、低級別炎癥的產生和維持過程中舉足輕重[4]，而近年來這種慢性、低級別炎癥被認為與IBS的發病密切相關。因此，我們推測IBS患者腸道菌群紊亂可能通過激活腸黏膜MC，進而誘導腸道內的慢性、低級別炎癥。基于以上背景，我們分析了IBS患者各亞型腸黏膜相關菌群特征，并初步探討IBS患者腸道菌群紊亂與其腸黏膜MC活化的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2018年9月～2019年1月在長治醫學院附屬和平醫院消化科門診收集IBS患者25例(IBS組)，其中男11例、女14例，年齡(47.16±11.01)歲；均符合IBS羅馬Ⅳ診斷和分型標準[5]，其中IBS腹瀉型15例(IBS-D組)、IBS不定型10例(IBS-U組)。IBS組納入標準：①年齡18～65歲；②符合IBS羅馬Ⅳ診斷和分型標準；③血尿便常規檢查無明顯異常；④腹部超聲、結腸鏡檢查無異常。排除標準：①合并其他疾病；②腹部手術史；③近1個月內曾連續使用抗生素>3 d；④近2周內連續服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動力藥超過>3 d；⑤處于月經期、妊娠或哺乳期。選取健康體檢疑似腸道腫瘤而病理活檢陰性者13例(對照組)，男6例、女7例，年齡(48.62±11.94)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集 研究對象均于檢查前晚餐后禁食，檢查前5 h將聚乙二醇電解質散139.12 g溶于2 L溫開水中，每10 min服用250 mL，2 h內服完。結腸鏡檢查過程中用活檢鉗在距肛門近端25～35 cm處取黏膜組織2塊，1塊立即保存于-80 ℃液氮中，用于腸道黏膜菌群多樣性及豐度檢測；另一塊置于90%乙醇中固定，石蠟包埋、保存，用于腸黏膜肥大細胞檢測。

1.3 腸道菌群測序與豐度分析 利用細菌基因組DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，嚴格按照使用說明書提取腸黏膜菌群DNA，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進行總DNA質檢。PCR擴增基因組DNA，擴增選擇區域為V3～V4區,引物為F341和R806[6]；采用ilumina MiSeq平臺測序，此部分由上海銳翌生物科技有限公司協助完成。將測序所得有效序列按照豐度從大到小排列，通過97%相似度的標準進行聚類，得到操作分類單元(OTU)；統計各個樣品每個OTU中的豐度信息，從各個OTU中提取1條豐度最高的序列作為代表序列與已知物種的16 S數據庫比對，從而對每個OTU進行物種分類。歸類后，根據每個OTU中序列的條數，得到OTU豐度表，根據OTU豐度表進行物種組成統計[7]。

1.4 腸道菌群多樣性分析 采用Alpha多樣性分析，包括Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數，其中Chao1指數用來估計樣品所含OTU的總數；Shannon指數和Simpson指數用來估算微生物群落的多樣性，值越大多樣性越高。

1.5 腸黏膜MC數量及MC脫顆粒檢測 將上述石蠟包埋固定好的標本制作成切片，脫蠟后用改良甲苯胺藍染色法進行染色。MC判斷標準：MC呈圓形或卵圓形，輪廓清晰，胞體較大，胞核常位于細胞中央，胞質內顆粒被染成紫藍色。而脫顆粒的MC輪廓不完整，胞膜出現明顯破裂、變形或有顆粒外逸。MC計數方法：在放大400倍鏡下觀察5個不重復視野，計數MC總數和脫顆粒數目，取相應數值的平均值。脫顆粒率(%)=MC脫顆粒數目/MC數目×100%。

2 結果

2.1 各組腸黏膜菌群在門水平主要組成情況 IBS-D組、IBS-U組及對照組腸黏膜相關菌群在門水平主要以變形菌、厚壁菌、擬桿菌為主。見表1。

表1 各組腸黏膜相關菌群在門水平主要組成成分比較(%)

2.2 各組腸道菌群Alpha多樣性指數比較 各組腸道菌群Alpha多樣性指數比較，差異無統計學意義。見表2。

表2 各組腸道菌群Alpha多樣性指數比較

2.3 各組腸黏膜菌群在屬水平的相對豐度比較 IBS-D、IBS-U組在屬水平毗鄰貧養菌豐度低于對照組、泰氏菌豐度高于對照組(P均<0.05)，IBS-D組在屬水平互營烴降解菌、卟啉單胞菌、大理石雕菌、心桿菌豐度高于IBS-U組、對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組腸黏膜菌群在屬水平的相對豐度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與IBS-U組比較，#P<0.05。

2.4 各組腸黏膜MC計數及MC脫顆粒率比較 各組MC計數比較，差異無統計學意義；IIBS-D組與IBS-U組MC脫顆粒均高于對照組(P均<0.05)，IBS-D組與IBS-U組比較差異無統計學意義。見表4。

表4 各組腸黏膜MC計數及MC脫顆粒率比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 MC脫顆粒率與毗鄰貧養菌、泰氏菌的相關性 Pearson相關分析發現，IBS組腸黏膜MC脫顆粒率與毗鄰貧養菌的豐度無明顯相關性(r=0.113，P>0.05)，與泰氏菌的豐度呈正相關(r=0.723，P<0.01)。

3 討論

研究表明，IBS患者存在腸道菌群失調，且這種變化可能與患者的腹痛癥狀相關[2,3]，而關于IBS患者腸道菌群組成或改變的特定模式尚無統一的報道。本研究結果表明，IBS患者腸黏膜菌群在門水平主要以變形菌、厚壁菌以及擬桿菌為主，菌群多樣性在IBS組與對照組之間沒有明顯差異，且在IBS-D與IBS-U兩種亞型之間也無明顯差異。這與Tap團隊[8]的研究結果一致。另外我們發現，IBS-D、IBS-U組在屬水平中毗鄰貧養菌豐度低于對照組、泰氏菌豐度高于對照組，IBS-D組中互營烴降解菌、卟啉單胞菌、大理石雕菌、心桿菌豐度高于IBS-U組、對照組。而此前的研究發現，與健康對照組相比，IBS組腸桿菌、厚壁菌、擬桿菌的比例增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌的比例減少[9]。產生這種差異的原因有：①研究對象的種族、飲食、文化、經濟條件和地理位置差異；②黏膜菌群和糞便菌群存在差異等。

毗鄰貧養菌屬于兼性厭氧的革蘭陽性球菌，是人類口腔、胃腸道和泌尿生殖道的正常共生菌群，在人體中很少引起疾病[10]。可能是由于這些人體共生菌的減少，削弱了腸黏膜的屏障功能，導致有害菌的定植增多。泰氏菌是一種革蘭陰性厭氧菌，常定植于人類胃腸道中，可在人體免疫力降低時引起機會感染，并可分解肌酐產生乙酸鹽[11,12]。研究表明，腸道菌群可通過代謝產生短鏈脂肪酸類物質如乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽等加重IBS患者的腹痛癥狀[13]。另外，我們的研究還發現，IBS-D組互營烴降解屬、卟啉單胞菌、大理石雕菌、心桿菌的豐度高于IBS-U組。有研究發現，互營烴降解菌可通過分解代謝產生甲烷[14]，這可能與IBS-D患者腹脹、腹部不適等癥狀有關。卟啉單胞菌、大理石雕菌可代謝產生脂多糖，而脂多糖可以影響腸道的滲透性[15～17]，這可能與IBS-D患者的腹瀉癥狀密切相關。目前關于心桿菌的生化特性鮮有報道，故關于其如何影響IBS-D患者有待進一步研究。

過去我們一直認為IBS是一種功能性疾病，因為其缺乏明顯的病理異常。然而，近年來在一些IBS患者的腸道都觀察到了低級別的炎癥浸潤，且通常富含MC[18]。MC可通過活化脫顆粒釋放多種炎癥介質來介導炎癥反應，因此有人認為腸黏膜MC浸潤數量的增加可能是IBS患者腸道持續性炎癥反應的原因[19]。然而，有學者發現，IBS患者腸道MC的數量沒有明顯變化，認為IBS患者腸黏膜MC的功能可能在IBS發病中起更重要的作用。因為MC的存在本身并不一定意味著它們是致病的，除非它們被激活[20,21]。本研究結果顯示，與對照組相比，IBS-D和IBS-U組的MC計數平均值沒有明顯差異，但是IBS組的MC脫顆粒率明顯高于對照組，兩個亞型的MC脫顆粒率無明顯差異。這一結果進一步支持了MC的功能在IBS的發病中起更重要作用的觀點。

研究表明，腸道菌群可直接或通過菌群代謝產物間接調節炎癥反應。腸道菌群失調可促進炎癥反應，削弱正常淋巴細胞的功能，最終維持慢性、低級別炎癥[22]。這已得到臨床證據的支持，即補充益生菌可以通過抑制MC脫顆粒釋放多種生物活性物質從而減輕IBS癥狀，并對腸道菌群的穩態產生持續的影響[23,24]。本研究顯示，泰氏菌的豐度與MC的脫顆粒率有明顯的相關性，而泰氏菌是一種機會致病菌。因此，我們推測IBS患者中泰氏菌豐度的增加通過激活MC，促使其脫顆粒增多，進而激活局部免疫炎癥反應。這表明腸道菌群的紊亂在腸道慢性、低級別炎癥的形成和維持中起著關鍵作用，亦或許是腸道菌群在IBS復雜發病機制中的一種情況。但是，由于腸道菌群檢測樣本的差異，目前還沒有統一的結論來明確哪一類菌群或菌群代謝產物的增加或減少，能夠促進腸道慢性、低級別炎癥的發生，以及這些因素到底如何調節炎癥反應尚不清楚，需要我們進一步研究探討。