長鏈非編碼RNA HOTTIP對肺腺癌A549細胞侵襲轉移能力及上皮間質轉化的影響

金文靜，楊華，王林宣，李珊珊，顧文超

上海健康醫學院附屬浦東新區人民醫院，上海201200

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，我國年新發病例占全球一半以上[1]。目前臨床肺癌治療以手術和放化療為主，但效果并不理想[2]。隨著生物靶向藥物的應用，患者的生存率明顯提高，但藥物種類的有限性及特定人群的局限性，均需要尋找更多、靶點人群更普遍的治療藥物。肺癌的轉移復發是患者死亡的主要原因，而腫瘤轉移與上皮間充質轉化(EMT)的關系密切。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一大類長度大于200 nt的功能性RNA，其雖無編碼蛋白的功能，但能在表觀遺傳調控、染色質修飾、轉錄及轉錄后調控等多個方面調控基因的表達，從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉移等[3]。HOXA末端轉錄本反義RNA(HOTTIP)是近年來新發現的一種lncRNA，其與肝癌、食管癌、胃癌等消化系統腫瘤的發生密切相關，被認為是一種癌基因[4]。目前，研究發現HOTTIP在肺癌組織中高表達，但其在肺癌侵襲轉移中的作用及可能的機制，尚不清楚。2018年2～8月，我們以肺腺癌A549細胞為研究對象，觀察了HOTTIP對A549細胞侵襲轉移能力及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 肺腺癌細胞株A549購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫；RPMI1640培養基、DMEM培養基、10%胎牛血清、100 mg/mL青霉素以及鏈霉素購自Sigma生物有限公司；攜帶HOTTIP-shRNA、HOTTIP 全長序列的慢病毒以及空白慢病毒由上海伯豪生物科技有限公司構建并驗證；RIPA細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，基質膠購自Thermo公司，Transwell小室購自Corning公司；小鼠抗人Vimentin、GAPDH 單克隆抗體及兔抗人E-cadherin單克隆抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗購自Proteintech公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與病毒感染 將A549細胞接種于含10%胎牛血清、100 mg/mL青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養基，置于37 ℃、5% CO2的常規細胞培養箱中培養。待細胞生長融合度達80%左右時，用0.25%胰酶消化細胞，并進行傳代。取處于對數生長期的細胞，將其接種于無血清培養基中培養。培養4 h 后，將細胞分為HOTTIP-shRNA組、HOTTIP組和空載對照組。HOTTIP-shRNA組加入攜帶HOTTIP-shRNA的慢病毒(100 MOI)，HOTTIP組加入攜帶HOTTIP全長序列的慢病毒(100 MOI)，空載對照組加入空白慢病毒(100 MOI)；共同孵育12 h后，加入嘌呤霉素繼續培養2周。

1.2.2 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。收集各組感染后的細胞，用0.25%胰酶消化后制成細胞密度5×105/mL的單細胞懸液。將Transwell小室提前5 min用磷酸緩沖液濕潤。在上室加入100 μL細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養基。將Transwell小室放置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養。12 h后取出并置于顯微鏡下，觀察到下室細胞明顯增多后終止實驗。用磷酸緩沖液沖洗后，以中性甲醛固定，進行蘇木素染色。顯微鏡下隨機選取5個視野，計算穿膜細胞數，取其平均值。

1.2.3 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。收集各組感染后的細胞，用0.25%胰酶消化后制成細胞密度為5×105/mL的單細胞懸液。以1×105/孔將細胞均勻地鋪于6孔培養皿中，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養。待細胞呈貼壁生長后6 h，每孔用10 μL移液槍的槍頭劃2條平行直線。用磷酸緩沖液沖洗3次，加入無血清培養基繼續培養24 h。分別于劃痕后0、24 h，在顯微鏡下觀察劃痕的寬度變化，用Image J軟件測量細胞的遷移距離，計算細胞遷移率。細胞遷移率=(24 h劃痕寬度-0 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4 細胞中EMT相關蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組感染后的細胞，加入RIPA細胞裂解液裂解。用蛋白質提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，以BCA法檢測蛋白質濃度；取蛋白樣品50 μg，于95 ℃水浴中加熱變性。轉移至SDS-PAGE 膠中，按照說明書進行電泳；濕轉法將電泳產物轉移至PVDF膜，用5% BSA封閉2 h。分別加入小鼠抗人Vimentin、GAPDH單克隆抗體和兔抗人E-cadherin單克隆抗體一抗，室溫孵育過夜；用TBST洗3次，每次5 min；加入HRP標記的山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h；用TBST洗3次，每次5 min；用ECL化學發光顯影，定影后用Image J軟件分析條帶光密度。以GAPDH作為內參，計算EMT相關蛋白與內參光密度比值表示其相對表達量。

2 結果

2.1 HOTTIP對肺腺癌A549細胞侵襲能力的影響 HOTTIP-shRNA組、HOTTIP組、空載對照組穿膜細胞的數量分別為(12.85±3.25)、(305.65±53.45)、(45.25±10.75)個，HOTTIP-shRNA組穿膜細胞數量低于空載對照組，而HOTTIP組穿膜細胞數量均高于HOTTIP-shRNA組和空載對照組(P均<0.05)。

2.2 HOTTIP對肺腺癌A549細胞遷移能力的影響 HOTTIP-shRNA組、HOTTIP組、空載對照組細胞遷移率為35.62%±10.45%、13.84%±4.12%、64.52%±14.24%，HOTTIP-shRNA組細胞遷移率低于空載對照組，而HOTTIP 組細胞遷移率均高于HOTTIP-shRNA組和空載對照組(P均<0.05)。

2.3 HOTTIP 對肺腺癌A549細胞EMT蛋白表達的影響 與空載對照組比較，HOTTIP-shRNA組細胞Vimentin表達減少、E-cadherin表達增加(P均<0.05)；與HOTTIP-shRNA組和空載對照組比較，HOTTIP 組細胞Vimentin表達增加、E-cadherin表達減少(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞Vimentin、E-cadherin表達比較

注：與空載對照組比較，*P<0.05；與HOTTIP-shRNA組比較，#P<0.05。

3 討論

肺癌主要病理類型包括腺癌和鱗狀細胞癌，其中腺癌約占肺癌的40%。肺腺癌以女性發病率較高，主要治療手段是手術和放化療，但患者病死率仍較高。表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑是近年來新開發的一類生物靶向藥物，主要包括吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等。因亞洲不吸煙女性人群的EGFR突變率較歐美高，該類靶向藥物在亞洲肺腺癌患者所取得的療效高于西方人群。但隨著應用的增加，耐藥問題逐漸凸顯，復發和轉移患者增加，且其對EGFR非突變患者幾乎無效。因此，仍需繼續探討肺腺癌的發病機制，尋找新的治療靶點，以提高患者的臨床療效。

研究表明，腫瘤的復發與轉移與腫瘤細胞的侵襲、遷移能力增強顯著相關，而EMT在其中起關鍵性作用。生理狀態下，EMT對于胚胎發育、組織發生等起重要作用；而如果腫瘤細胞發生EMT，細胞極性就會降低，細胞間的黏附蛋白大量丟失而細胞間質大量增加。由于腫瘤細胞的黏附力下降，且與周圍的細胞接觸減少，其運動和遷移能力增強，從而促進了腫瘤的侵襲、轉移。E-cadherin是一種上皮細胞標志蛋白，其對維持細胞間的緊密連接具有重要作用，可阻止細胞的運動和遷移；研究發現，敲除E-cadherin表達的轉基因小鼠，可誘導EMT發生導致腫瘤轉移[5]。相反，Vimentin是一種間質細胞標志蛋白，其對維持細胞骨架的完整性具有重要作用。大量研究發現，腫瘤發生EMT時，細胞中Vimentin表達增高，細胞的運動遷移能力增強[6]。

HOX基因是同源異型盒家族的一員，可分為HOXA、HOXB、HOXC、HOXD基因簇。該基因所表達的蛋白通過其序列特異性與相關的DNA結合，從而調控胚胎發育和細胞生長、分化[7]。HOTTIP定位于染色體7p15.2上，全長3 764 nt，是一種新發現的lncRNA[8]。因其定位于HOXA 染色體的5′端，沉默HOTTIP會抑制位于HOXA 5′端基因的表達而得名。HOTTIP的抑制效應與距離有關，對距其最近的HOXA13、HOXA11基因抑制效應最強，其次是HOXA10、HOXA9、HOXA7基因[9]；在腫瘤細胞中也基本遵循這一規律，如肝癌、胃癌及胰腺癌等[5，10]，但也有少量不同的報道[11]，這種差異可能與腫瘤的組織類型選取、實驗條件不同等有關。Li等[12]發現，敲除胰腺癌細胞HOTTIP基因，可以抑制EMT，進而減弱腫瘤細胞的侵襲能力。在動物實驗中，抑制裸鼠體內HOTTIP基因表達，能夠減緩結直腸癌的生長速度，該作用可能與沉默HOTTIP后p21基因表達上調進而抑制腫瘤細胞增殖有關[13]。由此可見，HOTTIP具有促癌基因的特性。

在非小細胞肺癌(NSCLC)組織和不同肺癌細胞株中，均發現HOTTIP表達升高，而HOTTIP高表達患者的淋巴結轉移數目多、TNM分期高且預后較差。采用RNA干擾技術降表達NSCLC細胞中的HOTTIP，可抑制腫瘤細胞增殖并減緩小鼠腹腔移植瘤的生長速度，認為該作用是通過調控Bax/Bcl2這一細胞凋亡的分子開關實現的[14]。另有研究發現，沉默HOTTIP 基因能夠下調其靶向基因HOXA13表達，從而參與肺癌的發生發展[15]。楊莉等[16]研究發現，在肺癌組織和細胞中HOTTIP表達增高，且與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期呈正相關；體外細胞學分析顯示，促HOTTIP表達可促進肺癌細胞95-D、A549增殖，而降表達后則能誘導肺癌細胞凋亡。這與周發忱等[14]的研究結論相一致。然而，以上研究均未觀察HOTTIP對肺癌細胞侵襲及轉移的影響。本研究以肺腺癌A549細胞為研究對象，通過感染攜帶HOTTIP-shRNA、HOTTIP全長序列的慢病毒及空白慢病毒；結果顯示，HOTTIP-shRNA組穿膜細胞的數量、細胞遷移率低于空載對照組，而HOTTIP組穿膜細胞的數量、細胞遷移率多于空載對照組和HOTTIP-shRNA組，差異均有統計學意義。Western blotting實驗顯示，HOTTIP-shRNA組細胞Vimentin表達較空載對照組減少、E-cadherin表達較空載對照組增加，差異有統計學意義；HOTTIP組Vimentin表達較空載對照組增加、E-cadherin表達較空載對照組減少。因此，HOTTIP可增強肺腺癌A549細胞侵襲轉移能力，可能與其調控Vimentin、E-cadherin蛋白表達，從而促進EMT形成有關。可見，HOTTIP可作為肺腺癌靶向治療的新靶點，為提高患者的治療效果提供了新的研究方向。