miR-21與多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后的關(guān)系及其對(duì)化療耐藥的影響和機(jī)制

程靈靈，魏曉晶，莊婧，劉莉莉 ，石林,任翠愛

1 濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東濰坊261000；2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所；3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；4 濰坊市人民醫(yī)院

近年來(lái)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，盡管來(lái)那度胺、沙利度胺和硼替佐米等新藥的應(yīng)用明顯提高了臨床療效，但是仍有部分患者預(yù)后較差，耐藥是MM患者生存預(yù)后差的主要原因[1,2]。miRNA是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，部分或完全與靶基因mRNA結(jié)合促使其降解或抑制其翻譯過(guò)程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達(dá)水平，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3,4]。miR-21在實(shí)體瘤或血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)普遍升高，是最早發(fā)現(xiàn)的發(fā)揮癌基因作用的miRNA之一。miR-21降低腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物如紫杉醇、5-氟尿嘧啶、曲妥珠單抗等敏感性[5～7]。2014年6～12月，我們觀察了miR-21在MM患者骨髓細(xì)胞中的表達(dá)，分析其與患者預(yù)后的關(guān)系；并以人MM細(xì)胞ARP1為研究對(duì)象，探討miR-21對(duì)MM細(xì)胞硼替佐米所致耐藥性的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 骨髓組織標(biāo)本與人MM細(xì)胞 收集2014年6～12月來(lái)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院淋巴瘤診療中心就診的36例MM患者的骨髓標(biāo)本，男20例、女16歲，年齡(54.8±10.2)歲，無(wú)疾病進(jìn)展生存期(PFS)為(46±12)月，總生存期(OS)為(82±44)月。選取13例健康供者(骨髓移植健康供者，實(shí)驗(yàn)室檢查后廢棄標(biāo)本)的骨髓標(biāo)本，男8例、女5歲，年齡(45±7)歲。兩者性別、年齡具有可比性。所有取材經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，受試對(duì)象均簽署知情同意書。MM細(xì)胞ARP1購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC)。

1.1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清(FBS)、青/鏈霉素、DMEM和RPMI1640購(gòu)自GIBICO公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Novartis公司；MM細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD138購(gòu)自德國(guó)美天旎公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司。CCK8購(gòu)自同仁公司；抗c-Myc抗體購(gòu)自 CST公司；抗Aurora A抗體購(gòu)自Abcam公司。miR-21模擬物、miR-21陰性對(duì)照序列、Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝體系、All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒均購(gòu)自GeneCopoeia公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人骨髓組織中MM細(xì)胞的分離 先以密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，再以每5×106個(gè)細(xì)胞中加90 μL PBS制成細(xì)胞懸液；每5×106個(gè)細(xì)胞加CD138磁珠10 μL ，4 ℃孵育15 min，過(guò)柱分離CD138陽(yáng)性漿細(xì)胞。

1.2.2 人骨髓組織中MM細(xì)胞miR-21檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 TRIzol法提取人骨髓組織中MM細(xì)胞總RNA，采用Nanotrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA在260～280 nm處的吸光度(A)，A260/A280在1.8～2.0，純度尚可。采用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以U6為內(nèi)參照，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)RNA豐度。以2-ΔΔCt計(jì)算miR-21相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 ARP1細(xì)胞培養(yǎng)與miR-21轉(zhuǎn)染 將ARP1細(xì)胞接種于含10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARP1細(xì)胞接種6孔板，3×105/孔；按照Lenti-PacTMHIV慢病毒包裝試劑盒使用說(shuō)明書，將miR-21模擬物和miR-control質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARP1，48 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和熒光情況。在熒光顯微鏡暗視野下可見綠色熒光，且轉(zhuǎn)染率達(dá)90%以上；按1.2.2方法檢測(cè)miR-21模擬物和miR-control干擾后ARP1細(xì)胞miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為9.87±0.13、1.02±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，將成功轉(zhuǎn)染miR-21模擬物、miR-control質(zhì)粒的ARP1分別命名為ARP1-OE細(xì)胞和ARP1-EV細(xì)胞。

1.2.4 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞化療耐藥性影響的觀察 采用CCK8法。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARP1-OE和ARP1-EV細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，以100 μL/孔接種6孔板；每孔中加入待測(cè)藥物10 μL，設(shè)置化療藥物硼替佐米濃度為5 μmol/L，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中,分別于孵育24、48、72 h時(shí)加CCK8溶液10 μL/孔，孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，以空白對(duì)照組調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)孔平均吸光度/對(duì)照孔平均吸光度×100%。

1.2.5 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞c-Myc、Aurora A表達(dá)影響的觀察 采用蛋白印跡法。取硼替佐米作用48 h的ARP1-OE和ARP1-EV細(xì)胞，用預(yù)冷的含蛋白酶體抑制劑的強(qiáng)RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白；用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μL；每孔上樣量20 μL,進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜。用5% TBST配制的脫脂奶粉封閉后，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min；加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次,每次10 min。以GAPDH為內(nèi)參，PVDF膜化學(xué)發(fā)光顯影，ImageQuant LAS4010成像分析儀拍照，以灰度比值表示c-Myc、Aurora A的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 MM患者和健康供者骨髓組織中MM細(xì)胞miR-21表達(dá)比較 MM患者骨髓組織中MM細(xì)胞miR-21表達(dá)水平1 153.97±424.06，高于健康供者的28.88±17.53(P<0.05)。

2.2 MM患者骨髓組織中MM細(xì)胞miR-21與預(yù)后的關(guān)系 miR-21高表達(dá)(miR-21表達(dá)≥平均值)的MM患者PFS為(45±15)月，短于miR-21低表達(dá)(miR-21表達(dá)﹤平均值)MM患者的(48±15)月，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-21高表達(dá)的MM患者OS為(56±6)月，短于miR-21低表達(dá)MM患者的(94±16)月(P<0.05)。

2.3 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞化療耐藥性的影響 硼替佐米作用下，ARP1-OE細(xì)胞存活率均高于同時(shí)點(diǎn)的ARP1-EV細(xì)胞(P均<0.05)。見表1。

表1 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞硼替佐米耐藥性的影響

注：與同時(shí)點(diǎn)ARP1-EV細(xì)胞比較，*P<0.05。

2.4 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞c-Myc、Aurora A表達(dá)的影響 硼替佐米作用48 h時(shí)，ARP1-OE細(xì)胞c-Myc和Aurora A表達(dá)水平高于ARP1-EV細(xì)胞(P均<0.05)。見表2。

表2 miR-21對(duì)ARP1細(xì)胞c-Myc、Aurora A表達(dá)的影響

注：與ARP1-EV細(xì)胞比較，*P<0.05。

3 討論

MM是僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，以骨髓中單克隆漿細(xì)胞異常增生并分泌單克隆免疫球蛋白為特征。MM常伴有多發(fā)性溶骨性損傷、高鈣血癥、貧血、腎臟損傷、細(xì)菌性感染等并發(fā)癥。近年來(lái)，新藥的應(yīng)用明顯提高了臨床療效，但是患者預(yù)后仍然較差，腫瘤耐藥是MM治療失敗的關(guān)鍵因素。

隨著人們對(duì)miRNA研究的逐漸加深，人們明確認(rèn)識(shí)到miRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在癌癥相關(guān)miRNA的研究中，miR-21在實(shí)體瘤或血液系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)普遍升高。研究表明，miR-21與多種腫瘤的化療耐藥有關(guān)[8～10]。Deng等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-21在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中表達(dá)升高，并增加癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性；抑制miR-21的表達(dá)可降低5-氟尿嘧啶的IC50，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。Gaudelot等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-21在腎細(xì)胞癌耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用，抑制miR-21表達(dá)可明顯降低多種耐藥基因的表達(dá)水平，增加腎細(xì)胞癌對(duì)紫杉醇、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和多維替尼等化療藥物的敏感性。Chen等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-21在耐藥的肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平明顯較高，過(guò)表達(dá)miR-21可直接靶向FASLG降低其轉(zhuǎn)錄和翻譯，明顯降低肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。研究表明，高表達(dá)的miR-21在肝細(xì)胞癌、胃癌、舌癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中介導(dǎo)耐藥[6,10～13]。

本研究結(jié)果顯示，與健康供者相比，miR-21在MM患者的表達(dá)水平升高；且miR-21高表達(dá)的MM患者OS明顯縮短，與之前的研究結(jié)果相一致[8～10]；但由于樣本量不足，miR-21表達(dá)水平高的MM患者PFS較短，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后期我們會(huì)繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。構(gòu)建miR-21過(guò)表達(dá)的MM細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)miR-21過(guò)表達(dá)可降低MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性，提示miR-21可調(diào)節(jié)MM對(duì)硼替佐米耐藥。

為進(jìn)一步探究miR-21在MM患者耐藥中發(fā)揮作用的機(jī)制，本研究經(jīng)過(guò)TargetScan、miRBase和miRTarBase等數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-21的靶基因，發(fā)現(xiàn)3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共有的靶基因包括Aurora A和c-Myc。c-Myc基因?qū)儆贛yc調(diào)節(jié)基因家族，編碼必要的核轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和細(xì)胞周期等[14]。在腫瘤細(xì)胞中，c-Myc過(guò)表達(dá)會(huì)激活一些下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致DNA合成增加，促進(jìn)細(xì)胞周期，增加染色體畸變發(fā)生率，最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和化療藥物抵抗[15]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc在舌癌、肺癌、結(jié)直腸癌和急性髓系白血病等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性[16～18]。Aurora A是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在有絲分裂中發(fā)揮重要作用，如中心體的成熟和分離、兩極紡錘體形成等。Aurora A在多種腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，Aurora A在非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌中過(guò)表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性，影響腫瘤患者的預(yù)后[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-21過(guò)表達(dá)的MM細(xì)胞中腫瘤相關(guān)耐藥基因c-Myc和Aurora A表達(dá)明顯增加。這提示miR-21可能是通過(guò)上調(diào)c-Myc和Aurora A表達(dá)，從而增加MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的耐藥性。

綜上所述，miR-21在MM患者的表達(dá)水平升高，miR-21高表達(dá)者OS明顯縮短；miR-21過(guò)表達(dá)可降低MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的敏感性，該作用與其上調(diào)c-Myc和Aurora A表達(dá)有關(guān)。因此，我們認(rèn)為miR-21可能是MM的潛在治療靶點(diǎn)，靶向miR-21有可能改善MM對(duì)化療藥物的耐藥性，改善MM患者的預(yù)后。