p62基因敲除后食管鱗狀細胞癌EC109細胞生物學行為變化

陳秀英，于莉，周君陽，丁妍，譚玉潔,4

1 貴州醫科大學，貴陽550004；2 三峽大學；3湖北醫藥學院 胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室；4 貴州醫科大學附屬醫院

食管癌是全球常見的惡性腫瘤之一，也是導致我國癌癥患者死亡的第四大原因[1]。2018年，我國大約有28.3萬人死于食管癌[2]。食管癌具有起病隱匿、進展迅速、治愈率差等特點。食管癌主要分為食管鱗狀細胞癌和食管腺癌兩種亞型，其中以食管鱗狀細胞癌最常見[3]。因此，尋找抑制食管鱗狀細胞癌生長的有效基因靶點并進行深入的功能研究，對于提高食管癌患者的生存率具有重要意義。p62是由SQSTM1基因編碼的信號樞紐蛋白，具有多功能結構域，能與多種信號通路關鍵因子結合，在信號網絡中發揮著重要作用，調控細胞的增殖、存活、死亡和炎癥反應、腫瘤發生發展、氧化應激[4～6]。然而，在食管鱗狀細胞癌中p62的功能研究較少。2018年1月～2019年9月，我們使用CRISPR/Cas9技術構建p62敲除的食管鱗狀細胞癌EC109細胞，觀察p62基因敲除后對EC109細胞增殖、遷移、集落形成能力及細胞周期等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 食管癌EC109細胞由湖北醫藥學院實驗室凍存，pGK1.2質粒購自美國Invitrogen公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，0.25%的胰酶購自上海碧云天生物技術有限公司；基因組提取試劑盒、凝膠純化/回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，細胞周期試劑盒購自南京凱基生物有限公司，T4連接試劑盒、T7E1核酸內切酶試劑盒購自北京唯尚立德公司；卡那霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司，瓊脂糖購自上海博亞公司；抗體購自北京博奧森公司，DH5α感受態細菌由本實驗室保存，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒的構建 采用CRISPR Design在線工具在靶標DNA區域中設計Oligo DNA序列，在引物合成靶序列頭部添加額外的堿基，以便pGK1.2載體形成黏性末端；正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，分別設計兩組Oligo DNA。Oligo1-SQSTM1上游引物5′-CACCGCACCGTGAAGGCCTACCTTC-3′、下游引物5′-AAACGAAGGTAGGCCTTCACGGTGC-3′，Oligo2-SQSTM1上游引物5′-CACCGACCGTGAAGGCCTACCTTCT-3′、下游引物5′-AAACAGAAGGTAGGCCTTCACGGTC-3′。將Oligo DNA退火形成引物二聚體，再與經BBSⅠ酶切的線性化pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin載體連接，轉化感受態細胞；挑菌落測序，測序正確的質粒進行后續實驗。

1.2.2 細胞培養與質粒轉染 將EC109細胞培養于DMEM高糖培養基(含10% FBS、1% 100 mg/L青-鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，在倒置顯微鏡下每天觀察細胞生長狀態；每2～3 d使用0.25%胰酶消化傳代，傳代比例為1∶3。敲除組轉染前接種于25 cm2細胞培養瓶預先培養24 h，再用0.25%胰酶消化細胞；將上述質粒電轉入細胞，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養48 h，加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選穩定轉染細胞株；同時，設未轉染質粒細胞作為對照組。篩選3 d，待對照組細胞死亡后停藥。

1.2.3 單克隆細胞的挑選及打靶鑒定 待細胞長到對數期時，用胰酶消化；挑取單個細胞置于96孔板中培養15 d，再轉移至6孔板中培養。待細胞融合率達80%左右，收集細胞，提取細胞基因組DNA。SQSTM1上游引物5′-AAGAGAGGGGTCAGCAATGA-3′，下游引物5′-TTATCTGAACCCACCACCTGG-3′。采用普通PCR擴增儀(BIO-RAD)擴增打靶位點上下游共約870 bp片段，擴增體系為20 μL。反應條件: 95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s進行34個循環，72 ℃ 10 min。采用T7E1核酸內切酶檢測打靶效果：T7E1檢測體系11 μL(DNA PCR產物5 μL，10×T7E1 buffer 1.1 μL，ddH2O 4.4μL)，使用普通PCR儀95 ℃ 5 min加熱變性，自然退火冷卻至室溫；在上述體系中加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃反應30 min后跑1%瓊脂糖膠進行檢測。隨機選取p62敲除后的單克隆細胞進行后續實驗。

1.2.4 p62蛋白檢測 采用Western blotting法。隨機選取T7E1酶切檢測為陽性的克隆進一步擴大培養，收集細胞。加入100 μL蛋白裂解液(含1∶100的蛋白酶抑制劑)，BCA法定量測定蛋白濃度。配置12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗人p62抗體、兔抗人GAPDH抗體)，于4 ℃孵育過夜；TBST洗3×10 min，加入二抗(HRP標記的抗兔IgG抗體)室溫孵育2 h；TBST洗3×10 min，采用ECL化學發光法顯色。用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白與內參灰度比值表示p62蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.5 細胞形態觀察 將適量的兩組細胞種于6孔板中，使其次日細胞單層融合度達70%左右。在倒置顯微鏡下，觀察細胞的形態變化。在100倍鏡下，隨機計數5個視野下的合胞體數量，取其平均值。

1.2.6 細胞增殖能力觀察 采用實時無標記動態細胞分析技術(RTCA)。取兩組生長狀態良好的細胞，調節細胞密度為1×104/mL。以200 μL/孔接種至E-plate板內，每組8個重復。置于RTCA培養系統中，于37 ℃、5% CO2培養箱內培養80 h，繪制細胞增殖曲線。RTCA儀器通過微電子生物感應芯片測得的阻抗值經標準公式推算獲得細胞指數(CI)，細胞數量越多，CI 值越高。

1.2.7 細胞隆形成能力觀察 采用單克隆實驗。用0．25%胰蛋白酶消化兩組細胞，以含10% FBS的高糖DMEM培養液分別將其配成細胞懸液。細胞計數后，以5×102/孔接種6孔板，每組設3個復孔；置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，3～5 d換液1次。培養15 d后肉眼可見集落形成，終止培養；吸棄培養液，以1×PBS洗滌3次；用10%甲醇固定細胞，0.1結晶紫染色20 min；再以流水洗去染色液，空氣干燥后拍照，用Image-Pro Plus6.0對細胞克隆數量進行計數。

1.2.8 細胞遷移能力觀察 采用劃痕實驗。預先在6孔板底面繪制數條參考線，用于定位劃痕位置。在6孔板中分別接種兩組細胞(5×105/孔)，每組設3個平行孔；培養24 h后，使用200 μL槍頭進行劃痕處理；PBS洗滌3次，將細胞在無血清培養基中培養。用裝有數碼相機(德國Zeiss公司)的倒置顯微鏡，觀察并拍攝0、48、96 h劃痕照片，使用Image Pro Plus 6.0軟件讀取劃痕面積。劃痕愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.2.9 細胞周期分布檢測 取兩組對數生長期細胞，接種于T75培養瓶中；待細胞融合率達90%時，使用胰酶消化，離心收集細胞；PBS清洗1次，用含70%乙醇的PBS在4 ℃冰箱固定過夜。分析前用PBS離心洗滌細胞，加入10 mg/L的RNaseA 1 μL，37 ℃孵育30 min；PI(終濃度為50 μg/mL)浸染15 min后，300目濾網過濾細胞懸液，上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

2 結果

2.1 T7E1酶切驗證結果 敲除組挑取的9、11、13、20號單克隆細胞在800 bp左右有敲除后的特異性條帶，對照組僅在870 bp左右有一條帶。12、16號單克隆細胞p62基因未敲除。

注：12、9、11、13、20、16為敲除組p62基因敲除后T7E1的酶切情況。

圖1 T7E1酶切法驗證p62敲除情況

2.2 兩組細胞p62蛋白表達比較 敲除組p62蛋白相對表達量為0.245±0.102，低于對照組的1.157±0.043(P<0.01)，表明食管癌EC109細胞p62敲除穩轉細胞株模型構建成功。

2.3 兩組細胞形態比較 敲除組細胞合胞體數量為(47.6±7.5)個/視野，多于對照組的(12.2±2.9)個/視野(P<0.01)。敲除組細胞形態與對照組相比，細胞較圓，且細胞邊界不清。

注：箭頭所指為細胞合胞體。

圖2 兩組細胞形態比較(×200)

2.4 兩組細胞增殖能力比較 與對照組比較，敲除組10 h后各時點CI值均低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同時點細胞增殖CI值比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.5 兩組細胞克隆形成能力比較 敲除組細胞克隆數為(216±24)個，低于對照組的(363±22)個(P<0.05)。

2.6 兩組細胞遷移能力觀察 敲除組48 h、96 h劃痕愈合率分別為33.11%±2.88%、54.59%±0.66%，分別低于對照組同時點的35.94%±3.53%、63.25%±0.14%，但96 h劃痕愈合率差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.7 兩組細胞周期分布情況比較 敲除組阻滯于G0/G1期的細胞比例為62.19%±1.27%，高于對照組細胞的47.63%±3.53%(P<0.05)。

3 討論

據統計，2012年全球食管癌新增病例大約為455 800例[7]，食管鱗狀細胞癌是其最常見的類型[3]。臨床實踐中，食管癌患者5年生存率僅有10%～25%[8]。因此，探索食管鱗狀細胞癌發生發展的分子機制對食管癌的診斷、治療具有重要意義。

p62是一種多功能結構域的樞紐蛋白[5]，包含了如PB1結構域、鋅指結構域、TB結構域、UBA結構域等一系列的結構域。這些結構域通過調控轉錄因子的活性，調控細胞的增殖、分化、轉移、死亡[9]。近年來，有研究表明，在多種腫瘤組織中如胃癌[10]、肝癌[11]、腎癌[12]中p62異常高表達；在異種移植模型中發現，p62敲除后能抑制腫瘤細胞侵襲和生長[13]，進一步說明p62在腫瘤的發生發展中具有重要作用。研究發現[14]，在食管鱗狀細胞癌中，p62表達異常增高，并且p62高表達與分化程度相關，說明p62在食管鱗狀細胞癌的發生發展中發揮重要作用。然而，p62對食管鱗狀細胞癌的影響如何，仍不明確。為此，我們進行了相應的研究與探討。

在本研究中，我們使用食管鱗狀細胞癌EC109細胞，進行p62基因敲除處理，建立EC109 p62基因敲除穩轉細胞株，觀察p62基因敲除后EC109細胞形態、增殖、遷移能力及細胞周期的改變。培養過程中發現，p62敲除后細胞形態發生了改變，敲除組細胞可見較多的類似于一層細胞膜包繞多個核的一團細胞質，即合胞體；敲除組細胞形態與對照組相比，細胞較圓，且細胞邊界不清。在細胞增殖實驗中，p62敲除后EC109細胞CI值低于對照組，說明p62敲除后抑制了EC109細胞的增殖能力；在單克隆形成實驗中，p62敲除后EC109細胞克隆形成數量顯著減少，且克隆相對細小，說明p62敲除后細胞的生存活力受到抑制；在劃痕實驗中，敲除組細胞96 h劃痕愈合率低于對照組，說明p62敲除后抑制了EC109細胞的遷移能力；在細胞周期檢測中，敲除組中G0/G1期細胞比例高于對照組，說明p62敲除后將細胞阻滯于G0/G1期。由此可見，p62基因敲除后抑制了食管癌EC109細胞的惡性生物學行為。這與近年來的相關文獻報道一致[13～15]。同時也有研究報道，p62可以調控細胞的生存、增殖、分化、轉移以及死亡[9,16,17]。當我們在EC109細胞中敲除p62后，細胞形成較多的合胞體，且細胞的惡性行為顯著受到抑制。合胞體主要是由于細胞融合或一系列不完全細胞分裂周期所致，細胞的形態發生改變，而形態又與功能密切相關。在我們的研究中，p62敲除后，細胞的形態發生了改變，細胞周期阻滯。于是，我們推測p62敲除后，在食管癌EC109細胞周期中可以促進細胞不完全分裂，使細胞周期阻滯，導致合胞體出現，從而改變食管鱗狀細胞癌的細胞形態及生物學功能。但是，p62是如何調節細胞周期、改變細胞形態，其具體機制如何，尚有待進一步研究探索。

綜上所述，在我們的研究中顯示，p62在食管癌EC109細胞的增殖、轉移、周期分布方面具有重要調控作用，可將其作為食管癌預測基因進行更加深入的研究，以期為食管癌的早期診斷、治療及預后提供科學合理的依據。