煙草抗旱相關基因的研究進展

金伊楠，張豪洋，張璐翔，魏爍果，王發展，陳思昂，熊亞南，朱智威，許自成

河南農業大學煙草學院，鄭州市農業路63號 450002

干旱脅迫是制約全球農業生產的重大問題之一，據統計全球因水分缺失所導致的作物產量下降的數值，已超過其他因素如鹽漬、高溫、冷害等造成的作物產量減少數值的總和［1］。植物遇到干旱脅迫后細胞含水率下降，活性氧平衡被打破，細胞膜系統受損，導致植物生長發育遲緩，嚴重者至死亡［2］。煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的種植規模較大的模式植物，近年來廣泛地用于抗干旱脅迫的研究［3］。因此，對煙草抗旱脅迫相關基因的研究進展進行了綜述，以期為煙草抗旱脅迫研究提供參考。

1 轉錄因子相關基因

轉錄因子在逆境脅迫中占有十分重要地位，可以啟動或限制參與應激反應的許多下游基因的轉錄信號轉導途徑，植物抵御非生物脅迫相關的轉錄因子家族主要有AP2/ERF、MYB、NAC、WRKY、ZFP 和bHLH 等［4］。

1.1 AP2/ERF 類轉錄因子

AP2/ERF 類轉錄因子在植物中分布廣泛，參與非生物脅迫中的抗逆信號誘導，通常可分為AP2、DREB 、ERF 和RAV 等［5］。

1.1.1 ERF 類轉錄因子

乙烯反應因子（ERF）是激活乙烯信號轉導途徑的關鍵轉錄因子，主要參與植物對生物脅迫的反應如發病機制，可與乙烯誘導發病相關基因的啟動子中存在的核心GCCGCC 序列結合［6］。

有研究表明，將番茄（Solanum lycopersicum）TERF1 基因導入煙草，可提高轉基因植株的抗旱性［7］；WANG 等［8］從麻風樹（Jatropha curcas L.）的葉片中分離出1 種新的ERF 型轉錄因子基因，命名為JcERF2，并將該基因導入煙草，游離脯氨酸和可溶性碳水化合物的積累增加，使煙草的抗旱性增 強；LI 等［9］將 大 豆（Glycine max（L.）Merr.）GmERF5 基因導入煙草，發現該基因參與誘導防御反應和ABA 介導的耐旱途徑，使轉基因植株對干旱脅迫的耐性提高；吳電云［10］將枸杞（Lycium chinense）LchERF 基因導入煙草，在干旱脅迫下轉基因煙草種子萌發率、葉綠素含量顯著高于空載體轉基因煙草，使其抗旱性增強。

1.1.2 DREB 類轉錄因子

DREB 是AP2/ERF 類轉錄因子家族的成員之一，可激活下游基因的表達，并與C-重復脫水反應（DRE/CRT）基因啟動子中的順式作用元件相結合，是植物抗逆境研究領域中的重點研究內容［11］。

劉俊學［12］研究發現，轉ItDREB2 基因煙株葉綠素含量增加，SOD、POD 和CAT 酶活性提高，對干旱脅迫的抗性增強；李春瑤［13］從甘蔗（Saccharum officinarum）中分離出SoDREB2 基因，在干旱脅迫下轉基因煙草植株細胞膜透性和葉綠素含量高于野生型煙株，并具有較高的抗氧化酶活性，其抗旱性增強；Li 等［14］研究表明，將準噶爾無 葉 豆［Eremosparton songoricum（Litv.）Vass］EsDREB2B 基因導入煙草，轉基因植株對多種非生物 脅 迫 的 耐 受 性 提 高；Yang 等［15］從 剛 毛 檉 柳（Tamarix hispida）中 分 離 出ThDREB 基 因，轉ThDREB 基因煙草植株抗氧化酶活性提高，活性氧保持在較低水平且易于被清除，其抗旱性增強；Zhang 等［16］試 驗 發 現 在 煙 草 中 過 表 達 堿 蓬 草（Suaeda glauca）SsDREB 基因可提高植株葉綠素、脯氨酸和可溶性糖含量，通過激活不同的下游基因，從而提高轉基因煙草對干旱和鹽脅迫的耐受性；Sharma 等［17］從蘋果（Malus domestica）中克隆獲得MdDREB76 基因，發現轉MdDREB76 基因植株通過誘導抗氧化酶活性而提高其抗旱性和耐鹽性；Liu 等［18］將桑樹（Morus alba L.）MnDREB4A 基因導入煙草，轉基因植株含水率和脯氨酸含量提高，丙二醛含量降低，過表達MnDREB4A 基因顯著提高了煙草植株對干旱、冷害、鹽和高溫脅迫的抗性。

1.2 MYB 類轉錄因子

MYB 是指含有MYB 結構域的一類轉錄因子家族，包括1～4 個不完全重復，每個重復有50～53 個高度保守的氨基酸殘基，形成螺旋-轉角-螺旋的結構［19］。

1993 年Urao［20］首 次 在 模 式 植 物 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）中發現了受脫落酸顯著誘導的AtMYB2 基因，并發現MYB 相關轉錄因子參與對水分脅迫反應基因的調控；Li 等［21］將杜梨（Pyrus betulifolia Bunge）PbrMYB21 基因導入煙草，轉基因煙草植株的精氨酸脫羧酶（ADC）表達水平高于野生型，多胺積累增加，表明PbrMYB21 在耐旱性方面發揮了積極作用，原因可能在于該基因調節ADC 的表達而促進多胺合成；Li 等［22］將番茄中的MYB 基因命名為SpMYB，將SpMYB 基因轉入煙草后植株丙二醛（MDA）積累減少，SOD 和POD 酶活性提高，苯丙氨酸解氨酶（PAL）積累增加，使轉基因煙草植株的抗旱性提高；Wei 等［23］從小麥（Triticum aestivum L.）中克隆了MYB 類轉錄因子TaODRANT1 基因，導入煙草中發現在模擬干旱脅迫（PEG6000 處理）時相對含水率較高、失水率降低，SOD 和CAT 酶活性較高，離子滲漏和MDA 活性較低，過表達TaODORANT1 基因可上調幾種與活性氧（ROS）和應激反應相關的基因表達量，增強轉基因煙草植株的抗旱性。

1.3 NAC 類轉錄因子

NAC 類轉錄因子是最大的植物特異性轉錄因子家族之一，與非生物脅迫的耐受性有關［24］。NAC 家族成員一般含有保守的NAC 結構域和一個多樣化的C 末端區域，已有研究表明NAC 類轉錄因子在轉錄激活中發揮一定作用［25］。

Liu 等［26］從花生（Arachis hypogaea Linn.）中克隆了AhNAC3 基因轉入煙草，干旱脅迫下轉基因煙草植株的3 種功能基因表達量上調，分別是超氧化物歧化酶（SOD）、吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5SC）、胚胎晚期豐富蛋白（LEA），AhNAC3 基因可激活其在細胞核中的特異性靶標，增加活性氧的清除，增強其抗旱性；Wang 等 將番茄SlNAC35基因導入煙草，在干旱脅迫下過表達SlNAC35 可促進煙株根系的生長發育，使抗旱性增強，推測該基因可能與生長素信號轉導和調節NtARF基因表達有關；Cao 等［28］研究表明，轉橡膠樹（Hevea brasiliensis）NAC1基因煙草對干旱脅迫的耐受性提高；Yang等［29］對轉甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）DlNAC1基因的煙草進行研究表明，DlNAC1 蛋白定位于細胞核并具有轉錄激活功能，轉基因煙株對干旱和鹽脅迫的耐受性顯著增強；Liu 等［30］發現在煙草中過表達陸地棉（Gossypium hirsutum L.）GhsNAC3 基因可增強抗旱性和耐鹽性，轉基因植株初生根較長，鮮質量較大。

1.4 WRKY 類轉錄因子

WRKY 類轉錄因子是植物中第二大轉錄因子家族，在衰老過程中起重要作用，是植物應對非生物脅迫的關鍵調節因子，因其獨特的轉錄功能而受到越來越多的關注［31］。WRKY 類轉錄因子通常包含1 個或多個保守的結構域，稱為WRKY 域，是一種新型的植物特異性鋅指轉錄調節劑，其N-末端具有高度保守的7 個氨基酸序列WRKYGQK，C端具有1 個C2H2 或C2HC 型的鋅指結構［32］。

Li 等［33］對轉番茄SpWRKY1 基因煙草進行研究，發現轉基因煙株MDA 含量降低，POD 和SOD酶活性提高，葉綠素含量、光合速率和氣孔導度增加，并且與應激防御相關基因的表達量增加，轉基因煙草對干旱脅迫的耐受性增強；Liu 等［34］對轉杜梨PbrWRKY53 基因的煙草植株進行試驗，發現在干旱脅迫下活性氧生成量減少，抗氧化酶活性提高，對干旱脅迫的抗性增強，推測可能是通過促進維生素C 的生成而調節了PbrNCED1 基因的表達；Gong 等［35］將金柑（Fortunella crassifolia）FcWRKY70基因導入煙草，使轉基因植株對干旱脅迫的耐受性增強；Sun 等［36］將二穗短柄草［Brachypodium distachyum（L.）Beauv］BdWRKY36 基 因 導 入 煙草，轉基因植株的離子滲漏和活性氧積累較少，葉綠素含量、相對含水率和抗氧化酶活性顯著高于對照植株，從而增強了抗旱性；Chu 等［37］對轉陸地棉GhWRKY41 基因煙草的研究表明，GhWRKY41 可以作為氣孔閉合的正調節劑，通過調節活性氧清除和抗氧化基因的表達，從而提高轉基因煙草的抗旱性。

1.5 ZFP 類轉錄因子

鋅指蛋白（ZFP）是一個數量龐大的轉錄因子家族，具有高度保守的鋅指（ZF）結構域，對基因表達調控起重要作用［38］。根據鋅指蛋白保守結構域不同，通?？煞譃镃2H2 型、C8 型、C6 型、指環型和C2HC 型等［39］。

Liu 等［40］從 枳［Poncirus trifoliata（L.）Raf］中克隆PtrZPT2-1 基因并導入煙草，PtrZPT2-1 定位于細胞核，在干旱脅迫下轉基因植株存活率、ABA、脯氨酸和可溶性糖含量提高，H2O2積累減少，推測該基因可能通過提高滲透水平從而增強了煙株的抗旱性。

SAP 基因家族的蛋白質具有2 個鋅指結構域，即N 端有1 個A20 結構域，C 端有1 個AN1 結 構域［41］，屬于AN1/A20 型鋅指蛋白。白戈等［42］克隆了煙草NtSAP5 基因，并發現過表達NtSAP5 的轉基因煙草植株具有較強抵御干旱脅迫能力，該基因可能是在根對干旱脅迫的響應中發揮作用。

1.6 bHLH 類轉錄因子

bHLH 是一種多功能轉錄因子，其蛋白質具有高度保守的（60 個氨基酸序列）結構域，根據功能不同通常可分為基本區域和HLH 區域［43］?；緟^域由15 個氨基酸組成，并且作為DNA 結合結構域發揮作用［44］。HLH 區域包含2 個用環連接的α-螺旋，該區域允許形成同源二聚體或異源二聚體。Babitha 等［45］將穇 子［Eleusine coracana（L.）Gaertn］EcbHLH57 基因導入煙草，在干旱脅迫下轉基因植株光合作用增強，H2O2和MDA 的積累較少，過表達EcbHLH57 基因可增強應激反應基因的表達，如LEA14、SOD 和APX 等，從而提高了煙草的抗旱性。

2 信號傳遞相關基因

植物在遭遇非生物脅迫時，首先在受刺激細胞內觸發化學信號分子的變化，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）、鈣離子（Ca2+）等均被認為是信號傳遞分子［46］。這些信號分子在濃度和信號強度方面發生變化，并伴隨著一系列復雜的信號轉換，多種信號組分共同完成植物抵御系統的激活［47］。

2.1 鈣依賴蛋白激酶合成相關基因

脫落酸（ABA）可抑制植物生長、促進果實脫落、引起氣孔關閉和增強植物抗逆性。Ca2+是ABA 信號通路中的第二信使［48］，當植物受到外界刺激后細胞內Ca2+濃度發生變化，從而形成鈣信號［49］。許多傳感器可以感知和轉移細胞鈣信號，其中包括鈣調磷酸酶B 蛋白（CBL），可高效地結合Ca2+，但該蛋白缺乏必要的協助結構域，必須與目標蛋白CIPK 結合形成CBL-CIPK 復合體才能傳導鈣信號，CBL-CIPK 復合體在抗逆境研究中發揮重要作用 。

CIPK 是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［51］。Luo 等［52］發現轉二穗短柄草BdCIPK31 基因煙草植株在氣孔關閉、離子穩態、活性氧清除和滲透物生物合成方面有積極作用，使其抗旱性增強；Wang 等［53］對過表達TaCIPK2 的煙草植株進行試驗，在干旱脅迫下氣孔關閉速度加快，失水率降低，MDA 和H2O2含量降低，SOD、POD 和CAT 酶活性提高，TaCIPK2 在轉基因煙草植株干旱脅迫響應中起到積極的調節作用。

2.2 水楊酸合成相關基因

水楊酸（SA）是一種可調節抗氧化酶活性的激素類物質，前人的研究多集中在外源施用SA 對植物非生物脅迫生理反應的影響，而對內源SA 在植物防御反應中的調節功能方面的研究仍較少［54］。

SA 具有兩個不同的合成途徑，即異分支酸合成途徑和苯丙氨酸氨裂解酶合成途徑［55］。其中催化SA 合成的關鍵酶包括異分支丙酮酸裂解酶（IPL）、異分支合成酶（ICS）、苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）和水楊酸結合蛋白（SABP）等［56］。Li 等［57］將枸杞LcSABP 基因導入煙草，發現LcSABP 轉基因植株可通過增加內源性SA 含量而促進活性氧清除，調節相關應激轉錄因子基因的表達，增強轉LcSABP 基因煙草植株對干旱脅迫的耐受性。

2.3 油菜素甾醇合成關鍵酶基因

油菜素甾醇（BRs）是重要的植物激素，除了參與植物生長發育，還與抵御非生物脅迫息息相關［58］。BRs 合 成 途 徑 關 鍵 酶 有CPD、DET2、CYP85A1 和CYP85A2 等［59］。Duan 等［60］將 菠 菜（Spinacia oleracea L.）SoCYP85A1 基因導入煙草，發現該基因可通過促進根系發育、消除活性氧積累和調節應激反應基因的表達，從而增強轉基因煙草的抗旱性；陳永富等［61］研究表明，模擬干旱處理條件下過表達胡楊（Populus euphratica）PeCPD 基因煙草的SOD 和POD 酶活以及可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著提高，葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量高于對照，使轉基因植株的抗旱性增強。

3 抗旱功能相關基因

3.1 滲透調節相關基因

3.1.1 甜菜堿合成途徑的關鍵酶基因

甜菜堿是一種具有相溶性的高效滲透調節物質，不僅參與植物滲透調節，還具有非滲透調節的功能［62］。甜菜堿醛脫氫酶（BADH）是甜菜堿合成途徑中的關鍵酶，而煙草自身不能合成甜菜堿，可通過基因工程的方法將甜菜堿和煙草連接在一起 。王貴平 對轉BADH 基因煙草的研究發現，在干旱脅迫下轉基因煙草植株自身可合成甜菜堿，且葉片的類囊體片層結構受到一定保護, 進而減輕了干旱脅迫對葉綠體超微結構的破壞，葉片相對含水率較高，光合速率維持在較高水平，使抗氧化酶活性提高，可溶性糖含量增加，其對干旱脅迫的耐受性增強。

3.1.2 脯氨酸合成途徑的關鍵酶基因

脯氨酸是一類分子量小、水溶性高的小分子有機化合物。有研究表明，植物細胞中脯氨酸含量增多可增強植物在干旱脅迫時的滲透調節能力，從而增強植物的抗旱能力［65］?！?-吡咯琳-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸合成途徑中前兩步反應中的關鍵限速酶。 Kishor 等［66］研究發現，將P5CS 基因導入煙草，轉基因植株中脯氨酸含量明顯增加，可促進根系生長，植株抵御非生物脅迫的耐受性增強；陳吉寶等［67］對過表達菜豆（Phaseolus vulgaris）PvP5CS2 基因進行研究，干旱處理后轉基因煙草植株中脯氨酸含量增加，轉基因煙草對干旱脅迫的抗性增強。

3.2 抗氧化代謝相關基因

抗壞血酸（AsA）是一種普遍存在于植物體內的抗氧化物質，GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMPase）是AsA 合成途徑中的關鍵酶，其在活性氧清除機制中起關鍵作用［68］。Ai 等［69］從抗旱、耐鹽植物金發草（Pogonatherum paniceum）中克隆了PpGMPase 基因，導入煙草中發現種子發芽率、AsA含量提高，MDA 和H2O2含量降低，過表達PpGMPase 基因的煙草可通過增加AsA 含量來提高對鹽和干旱脅迫的耐受性，從而增強植株對活性氧的解毒功能。

CuZnSOD 是植物細胞質和葉綠體中的一種超氧化物歧化酶。Faize 等［70］對過表達CuZnSOD 基因煙草的研究發現，轉基因煙草植株水分利用效率和光合速率較高，抗氧化酶活性提高，緩解了干旱脅迫條件下煙株的損傷。

3.3 功能蛋白相關基因

3.3.1 LEA 蛋白

脫水蛋白，也稱為第2 組或D-11 家族晚期胚胎發育豐富（LEA）蛋白，是一個高度親水、富含甘氨酸、熱穩定和本質上非結構化的蛋白家族［71］。Bao 等［72］從梅（Prunus mume）中獲得了4 種脫水蛋白基因PmLEA10、PmLEA19、PmLEA20和PmLEA29，將其導入煙草后發現外源PmLEAs 基因可增強煙草的抗旱性；杜蕊［73］對轉西伯利亞蓼（Polygonum sibiricum Laxm.）LEA 基因煙草的研究發現，轉基因植株可溶性蛋白含量增加，細胞脫水減少，光合系統傷害降低，有效提高了轉基因植株的抗旱能力。

3.3.2 F-box 蛋白

泛素26S 蛋白酶體（UPS）是細胞內蛋白質降解的主要途徑，參與80%以上的蛋白質降解，在植物生長發育中起關鍵作用［74］。泛素連接酶E3 是UPS 途徑中的關鍵酶，根據E3 連接酶的基序不同可 分為SCF 型、HECT 型、APC 型 和Ring finger型，其中SCF 復合體由Skp1 蛋白、cullin 蛋白、Rbx蛋白和F-box 蛋白組成［75］。F-box 蛋白具有底物識別的功能，對植物的抗逆性研究有重要意義。

Zhou 等［76］將小麥TaFBA1 基因導入煙草，發現轉基因煙草植株發芽率、相對含水率和凈光合速率較高，抗氧化酶活性較高，轉基因植株的抗旱性增強；Kong 等［77］研究表明，小麥F-box 蛋白基因TaFBA1 的過表達可以改善轉基因煙草植株對干旱脅迫的耐受性，并且植株活性氧積累較少，MDA 含量較低，抗氧化酶活性水平提高，抗氧化相關基因的表達上調。

3.3.3 熱休克蛋白

熱休克蛋白（HSPs）是植物受到熱量或其他因素的刺激時，產生的一種高度保守的應激蛋白［78］。根據分子量的不同可分為5 種類型，HSP100/ClpB、HSP90、HSP70/Dna、小熱休克蛋白（sHSP）和伴侶蛋白（HSP60 / GroEL）［79］。其中HSP90 蛋白家族是真核生物細胞質中廣泛存在的分子伴侶，具有高度保守性。Song 等［80］對煙草NtHSP90 基因家族進行研究，鑒定出21 個NtHSP90，并根據系統發育分析將其分為11 類（NtHSP90-1 至NtHSP90-11），其 中NtHSP90-4、NtHSP90-5 和NtHSP90-9 的表達受干旱脅迫的誘導而上調。

HSP70 具有促進蛋白質折疊、生物膜之間多肽的移動和降解錯誤折疊蛋白的功能，但HSP70蛋白不能單獨作用，還需要與調節蛋白Dna J 和Grp E 共同作用［81］。李軍旗［82］對煙草NtDnaJ1 基因在干旱脅迫下的功能的分析發現，NtDnaJ1 基因主要在葉和花中表達，且受干旱脅迫的誘導，過表達NtDnaJ1 基因的煙草植株抗旱性增強。

3.3.4 脂質轉移蛋白

脂質轉移蛋白（LTPs）是分子量小的分泌蛋白，因其具有親和性，又稱為非特異性脂質轉移蛋白［83］。根據分子量大小LTPs 通?？煞譃? 類，LTP1、LTP2 和LTP3［84］。Xu 等［85］對 過 表 達 煙 草NtLTP4 基因的煙草的研究發現，過表達植株活性氧清除酶的表達水平與活性提高，可通過降低蒸騰速率而增強煙草對干旱脅迫的耐受性。

4 展望

干旱脅迫是非生物脅迫中的重點研究領域，而煙草作為重要的模式植物和經濟作物，一直以來都是學者們關注的熱點。隨著研究者們對煙草抗干旱脅迫方面的研究不斷擴展和深入，目前，已對幾類重要的轉錄因子家族、植物生長激素、植物生長調節劑和功能蛋白等方面的基因進行研究，并取得很大進展，但是仍存在一些問題：①在煙草抗旱相關基因的研究中，重心大多集中在其他植物抗旱基因在煙草中的應用，煙草自身與抗旱相關的基因還有待進一步發掘與深入研究。②基因工程已經成為植物抗旱性研究的重要手段，但是大多數研究僅涉及將外源基因導入煙草并進行功能驗證，只有少數研究涉及基因敲除技術，尚未有研究涉及抗旱脅迫突變體等方面。③目前研究大多停留在轉基因植株的生理指標測定，而對植物響應干旱脅迫的機制尚不明確，尤其是對外源基因轉入煙草后的作用機制尚不清楚。④抗旱相關基因仍有待發掘，缺乏系統的資源數據庫對現有研究進行歸納整合。⑤大多研究是在模擬干旱條件下進行，如何使研究成果更加高效且有效地應用于生產實踐。

針對上述的問題，在未來的研究中可利用免疫共沉淀、酵母雙雜交和DNA 分子標記等分子技術，揭示煙草抗旱相關的轉錄因子和信號轉導途徑；全面綜合分析煙草對干旱脅迫的響應機制，建立科學、有效的煙草抗旱基因數據庫和評價體系；運用分子育種彌補傳統育種的欠缺，提高育種水平；將實驗室室內試驗與田間試驗相結合，尋找可有效服務于田間種植的抗旱方法。此外，還可運用基因芯片、基因沉默和酵母雙雜交等分子生物學技術深入研究并發掘出更多新的抗旱基因。