腸道菌群檢測與臨床應用的研究進展

吳培東

天津市第五中心醫院 （天津 300450）

1 檢測方法

1.1 細菌涂片與培養

細菌涂片是病原學診斷的經典方法，也是最直接、最簡便、最快速的方法，但此方法對于種類繁多、數量龐大的腸道微生態系而言，僅可鑒定其中的1%，不能反映腸道微生物的真實情況，分析的結果與結論存在一定局限性。

1.2 聚合酶鏈式反應（PCR）技術

1.2.1 針對16SrRNA、16SrDNA檢測

16SrRNA為原核生物的核糖體RNA，該基因在細菌各種屬之間既有高度保守的序列又有相互之間存在差異的堿基，且該基因種類少、豐度高（約占細菌RNA含量的80%）、分子大小適中，目前已廣泛用于腸道菌群種屬的鑒定，其缺點是只能鑒定已知菌群。原核生物核糖體小亞基16SrDNA，長度約1 500 bp，且其較16SrRNA穩定，不易受污染降解，易于發現新的菌種。

1.2.2 多重PCR快速檢測

樣本同時被多對引物擴增，腸道菌群的特有基因在電泳圖譜上得到顯示，從而達到鑒定的目的。

1.3 腸道菌群DNA指紋圖譜技術

該類技術主要包括9種：（1）傳統DNA指紋技術；（2）變性梯度凝膠電泳（DGGE）；（3）溫度梯度凝膠電泳（TGGE）；（4）PCR解鏈曲線分析技術（PCR melting profile）；（5）脈沖場凝膠電泳（PFGE）；（6）多位點可變數目串聯重復序列分析（MLVA）；（7）限制性片段長度多態性（RFLP）；（8）ERIC-PCR指紋圖譜技術；（9）隨機擴增多態性DNA技術（RAPD）。在以上方法中，PFGE在特異性、分辨性方面較理想，同時操作簡便，是目前細菌分子分型的金標準[1]。

1.4 分子探針技術及基因芯片技術

熒光原位雜交技術（FISH）在鑒定腸道菌群方面有較多應用，樣本中的基因在標記特異寡聚核苷酸探針下，與已知腸道細菌的特異性DNA雜交，鑒定細菌種屬。基因芯片技術又稱DNA芯片，是固定的大量探針，標記樣品與已知腸道細菌的特異性DNA雜交，通過檢測雜交信號，達到鑒定的目的。

截止到2018年8月，拉薩市印刷行業小微企業共計237戶。主要分布情況如下：布達拉宮——大昭寺商業圈從事印刷行業商戶共計59戶；西藏大學商業圈(江蘇路-藏大東路一線)47戶；柳梧新區商業圈36戶；拉薩市經濟技術開發區22戶。四個主要商業圈合計164戶，占據拉薩市印刷行業企業總數的69.20%。剩余企業則分散在拉薩市區周邊，尚未形成集聚現象。

1.5 腸道細菌的定量檢測技術

競爭性PCR技術，在模板中加入一種已知濃度的模板，組成2個PCR反應，根據引物位置和條帶缺失，達到鑒定的目的。熒光定量PCR技術，是對反應體系中產物熒光信號實時檢測的技術，用于腸道菌群基因分型、突變的鑒定。

2 臨床應用

2.1 消化系統疾病

2.1.1 非酒精性脂肪肝

在對非酒精性脂肪肝患者與正常對照組的研究中發現，厚壁、變形菌屬的豐度增多，而擬桿菌屬則降低，同時整體腸道菌群的多樣性降低[2]。Liu等[3]通過給予SD大鼠不同類型的飲食發現，高脂肪和高糖飲食對非酒精性脂肪肝的誘導作用與熱量攝入無關，而與腸道菌群的變化有關，提示腸道菌群可能在非酒精性脂肪肝的發病中發揮重要作用。

2.1.2 肝硬化

有研究對肝硬化患者腸道菌群基因測序進行分析，發現腸道菌群結構發生改變，鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、韋榮球菌、普氏菌菌屬的豐度增高，而擬桿菌屬豐度下降，共28種細菌關系緊密，今后可作為治療的觀察指標[4]。

2.1.3 慢性便秘

研究顯示，成年便秘患者腸道內雙歧桿菌、柔嫩梭菌、乳酸菌及產丁酸鹽細菌的含量明顯降低，而硫酸鹽還原細菌數量上升，利用16SrRNA高通量測序技術發現，與對照組相比，便秘患者腸道內的普氏菌的豐度明顯降低，幾種代表性的厚壁菌豐度增加[5]。同時，有研究觀察到銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌等條件致病菌有所增加[6]。

2.2 代謝性疾病

2.2.1 肥胖

相對于正常體重者，肥胖者的腸道菌群結構發生改變，擬桿菌屬的豐度下降，而厚壁菌屬豐度上升。

2.2.2 糖尿病

腸道菌群失衡可破壞正常能量儲存過程，且可產生細菌毒素，引起臟器炎癥，加重胰島素抵抗。1型糖尿病兒童，隨著時間及疾病的進展，相對豐富的厚壁菌減少，擬桿菌增加，但與其年齡及HLA相匹配的健康兒童，厚壁菌相對增加，擬桿菌減少。2型糖尿病患者腸道厚壁菌屬比例降低，擬桿菌屬、大腸埃希菌等條件致病菌水平升高，雙歧桿菌等益生菌的含量明顯減少。Sato等[7]發現乳酸菌屬中的一部分致病菌或條件致病菌的豐度增加。

2.2.3 骨代謝疾病

Yan等[8]在長達8個月的小鼠糞菌移植實驗中發現，微生物在糞菌移植初期會同時介導骨形成與骨吸收相關因子增加，導致骨轉換暫時加快；隨著移植期變長，則對骨形成的影響占主導地位，促進了小鼠長骨的縱向與徑向生長，使骨量趨于均衡，且發現其作用機制可能與雌激素水平相關。Li等[9]發現腸道菌群主要通過介導炎癥反應，調節激素代謝及腸上皮營養物質轉運等途徑作用于骨骼系統。此外，腸上皮黏膜通透性改變也是引起小鼠去勢后骨量改變的機制之一。

2.3 自身免疫疾病

Miyake等[10]較早觀察到多發性硬化（MS）患者腸道菌群的變化，發現與正常對照相比，MS患者梭狀芽孢菌屬、擬桿菌屬、普氏菌屬和薩特菌屬減少，這種變化在一定時間內保持相對穩定。有研究顯示，炎癥性腸病帶狀皰疹的發病率比非炎癥性腸病高[11]。通過比較特應性皮炎嬰兒與皮膚正常嬰兒的腸道菌群發現，前者含有較多的梭狀芽孢桿菌，而后者含有更多的雙歧桿菌和乳酸桿菌。

2.4 循環系統疾病

心血管疾病患者的腸道菌群與健康人的腸道菌群相比在數量上發生了較大的變化，心血管疾病患者的大腸桿菌、腸球菌、鏈球菌數量均比健康人升高，這些升高的組分多是條件致病菌和過路菌。在慢性心力衰竭患者的糞便中，腸道菌群的豐富度降低，如布勞特菌和柯林斯菌，而沙門菌、彎曲桿菌、志賀菌、小腸結腸炎耶爾森菌和念珠菌的數量增加[12]。張月和楊得振[13]研究發現，急性心肌梗死患者與非冠心病患者真菌、類桿菌屬、雙歧桿菌屬、普拉梭菌、乳酸桿菌屬、梭菌屬Ⅰ、叢生梭菌、梭狀芽孢桿菌、腸桿菌、腸球菌均存在顯著差異，急性心肌梗死患者乳酸桿菌、腸球菌下降明顯，腸桿菌升高明顯。

2.5 神經系統疾病

Keshavarzian等[14]在對帕金森病的研究中發現，腸道菌群釋放的炎性物質，使腸管通透性增加和細菌易位，造成腸道神經系統損傷，引起帕金森病。Singh等[15]研究急性腦卒中對腸道菌群的影響，發現在嚴重腦卒中3 d后，腸道菌群的多樣性顯著降低，厚壁菌屬、擬桿菌屬和放線菌屬中特定細菌屬有所改變，這是腦卒中后微生物群失調的一個重要特征。游超等[16]通過對腦梗死患者及健康人糞便樣本提取的細菌DNA進行16SrRNA測序分析發現，腸桿菌、鏈球菌、韋榮球菌增加，擬桿菌、普氏菌減少。

2.6 腎臟疾病

在慢性腎臟病患者中，原有腸道菌表現為益生菌比例減少而產毒素菌群增加。有研究發現，短狀桿菌、鹽單胞菌科、莫拉氏菌、腸桿菌、假單胞菌增加，乳酸桿菌和普氏菌下降[17]。

2.7 精神疾病

有研究發現，胃腸功能紊亂、炎性腸病、抑郁癥、自閉癥患者均存在腸道菌群改變。有動物實驗表明，處于長期受壓狀態的小鼠，腸桿菌減少，梭菌屬增多[18]。

2.8 腫瘤

在對胃癌患者腸道菌群的研究中發現，厚壁菌、擬桿菌、梭桿菌、放線菌減少，而螺桿菌增加，胃炎患者沒有以上表現[19]。

3 小結

腸道菌群與人體的關系密切，在一些疾病中有一定的特定變化。隨著檢測技術的進步、發展，腸道菌群檢測將很快得到開展并服務于臨床工作，為疾病的診斷與治療提供新的方法。