手足口病病原學(xué)及檢測方法的研究進展

李潤祥

天津市寶坻區(qū)疾病預(yù)防控制中心 （天津 301800）

近年來，手足口病發(fā)病率的日益升高對嬰幼兒的健康成長及良好發(fā)育造成了一定的不良影響，促使醫(yī)療相關(guān)領(lǐng)域開始加大研究力度，并采取有效的措施預(yù)防該病。研究發(fā)現(xiàn)，手足口病病因是腸道病毒感染［1］，主要病原體為CA16與EV71。本研究主要分析手足口病的病原學(xué)，并對檢測方法進行綜述。

1 手足口病的病原學(xué)

1.1 CA16的國內(nèi)外研究進展

CA16菌株可分為A、B1、B2三種基因型，而B1基因型可繼續(xù)分為B1a、B1b、B1c三種亞基因型。相關(guān)研究報道，第1株CA16是1951年南非學(xué)者在遲緩性麻痹乳鼠腦組織中分離出來的，而CA16引發(fā)的手足口病于1957年在多倫多首次爆發(fā)［2］。1995年后，日本首次分離出B1型菌株，在B1型菌株中，B1a、B1b基因型菌株共同循環(huán)，2004年后B1b基因型菌株開始成為優(yōu)勢菌株。國外學(xué)者報道，馬來西亞、日本與中國是報道B1a基因型菌株最多的國家，并且B1b基因型菌株在中國內(nèi)地是優(yōu)勢菌株，因此，在B1a、B1b基因型菌株的共同作用下可引發(fā)手足口病的流行［3］。此外，相關(guān)研究表明，CA16與EV71可同時對人體造成感染，在共同感染的情況下可為這兩種病原體基因重組提供有利機會［4］。

1.2 EV71的國內(nèi)外研究進展

與CA16的共同點在于，EV71同樣可分為A、B、C三種基因群，不同的是B基因群可分為五種亞型（B1、B2、B3、B4、B5），C基因群也可分為五種亞型（C1、C2、C3、C4、C5），并且C4亞型還可分為C4a、C4b。1969年，美國已有學(xué)者在腦炎患兒糞便中首次分離出EV71［5］，1997年后EV71引發(fā)的手足口病開始廣泛流行于亞太地區(qū)，其中以B5、C2、C4作為優(yōu)勢菌株交替流行于日本，中國臺灣則是先后爆發(fā)流行C2、B4、C4等亞型菌株，但是中國內(nèi)地僅觀察到C4亞型菌株流行。在手足口病規(guī)模流行期間，不同基因型別進行交替，在基因重組的誘導(dǎo)作用下可為病毒突變形成新型基因菌株創(chuàng)造機會，進而引發(fā)不同型別的病毒。

2 手足口病的檢測方法

手足口病的早期診斷是改善患兒病情并控制疫情的關(guān)鍵。目前，臨床上針對手足口病的檢測主要應(yīng)用病毒分離培養(yǎng)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）與反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）等實驗室檢測方法。

2.1 病毒分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)是臨床上診斷手足口病的常用方法之一，其中主要應(yīng)用非洲綠猴腎細胞 （Vero）、人橫紋肌肉瘤（RD）細胞與人胚胎成纖維細胞（MRC-5）等細胞實現(xiàn)腸道病毒培養(yǎng)過程，而最常用于分離培養(yǎng)并鑒定CA16與EV71的細胞是RD細胞，一般取患兒肛拭子、咽拭子或糞便等制成懸液，同時取上清與敏感細胞接種，實現(xiàn)擴增培養(yǎng)的過程，時間為7～14d。有研究報道，將尸檢取下的組織做病理分離培養(yǎng)處理，在鑒定病毒時應(yīng)用間接免疫熒光法，在此基礎(chǔ)上還可結(jié)合qRT-PCR、RT-PCR等其他方法檢測分離后的病毒［6］。有學(xué)者分別應(yīng)用病毒分離培養(yǎng)法、RT-PCR法對腸道病毒進行檢測，陽性率分別為3.6%、68.5%［7］。同時，以病毒分離培養(yǎng)法作為手足口病的診斷金標準，但該檢查方法存在一定缺陷，即病毒培養(yǎng)時間過長，不適用于早期病情診斷［8］。此外，培養(yǎng)病毒的要求相對較高，需要醫(yī)院具備二級生物安全實驗室、生物安全柜，并且檢驗人員需接受專業(yè)培訓(xùn)后方可進行操作，因此，病毒分離培養(yǎng)法在大部分基層醫(yī)院中沒有開展。

2.2 RT-PCR與半巢式RT-PCR

近年，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，拓寬了病原體檢測的途徑。通常，在手足口病檢測過程中，主要是針對高度保守5’ -UTR非編碼區(qū)做擴增處理，因此，現(xiàn)階段已有大量學(xué)者依據(jù)位點對特異性引物與探針進行設(shè)計［9］。學(xué)者以5’ -UTR非編碼區(qū)、VPI基因序列為依據(jù)設(shè)計出半巢式RT-PCR引物［10］，用于CA16、EV71與其他腸道病毒的檢測中。而有些學(xué)者則結(jié)合正向（MD91或OI26）、反向（OI68-1或OI27）引物，并應(yīng)用一步法RT-PCR對5’ -UTR-VR4-VP2基因序列與5’ -UTR做擴增處理，在此基礎(chǔ)上選取600例手足口病患兒糞便、咽拭子與皰疹液等樣本檢測CA16、EV71與其他腸道病毒，結(jié)果顯示，陽性率達到91.50% （549/600），再應(yīng)用病毒培養(yǎng)法檢測549份陽性標本，結(jié)果顯示，陽性率僅為55.92% （307/549），分析結(jié)果可見，在手足口病檢測靈敏度比較上，RT-PCR法優(yōu)于病毒培養(yǎng)法［11］。此外，有學(xué)者改良出雙重RT-PCR法，該方法可在單管中對EV71與其他腸道病毒進行同時檢測，在165例樣本中，EV71檢測陽性率為46.1%，相對高于病毒分離法的陽性率（3.6%）［12］。因此，RT-PCR技術(shù)具有特異度、靈敏度均較高的特點，適用于手足口病感染的早期診斷，并且現(xiàn)已成為臨床上檢測手足口病病原學(xué)的主要手段。

2.3 血清中和抗體試驗

腸道病毒入侵人體后，為抵抗病毒感染，機體將會產(chǎn)生水平較高的免疫球蛋白G（IgG），因此，有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)，感染EV71后，僅需1d即可在血清中檢測出EV71中和抗體，并且患兒發(fā)病后中和抗體幾何平均滴度（GMT）為24.3，顯著高于正常兒童GMT（7.4）［13］。然而，血清中和抗體試驗在檢測過程中需要稀釋采集的血清，并且與固定量的病毒在37.5℃的條件下于二氧化碳培養(yǎng)箱中進行孵育，于2h后接種于人RD細胞中培養(yǎng)4～7d，在手足口病的早期診斷中意義不大，因此更適用于腸道病毒分離后血清學(xué)分型與血型流行病學(xué)調(diào)查中。

綜上所述，手足口病是由多種腸道病毒引發(fā)的傳染病，對嬰幼兒造成的傷害不容忽視。目前，臨床上已有多種實驗室檢測方法可檢測出手足口病，這些檢測方法各具優(yōu)勢。