五指山豬背最長肌和半腱肌DNA甲基化檢測分析

晁 哲，孫瑞萍，劉海隆，邢漫萍，鄭心力

（1.海南省農業科學院畜牧獸醫研究所，海南 海口 571100；2.海南省家畜家禽工程技術研究中心，海口 571100）

表觀遺傳（Epigenetic inheritance）是指在不改變DNA序列的情況下，基因表達模式發生可遺傳的變化。換言之，它是一種DNA序列之外的遺傳方式。表觀遺傳學（Epigenetics）則是研究不涉及DNA序列改變的基因表達、調控的可遺傳變化機制，或者說是研究從基因演繹為表型的過程和機制的新興遺傳學分支。迄今為止，表觀遺傳學研究的主要內容包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質結構、X染色體失活和非編碼RNA調控等。DNA甲基化對骨骼肌發生具有重要的調控作用，它參與調節肌肉發育及再生過程中相關基因的轉錄[1-2]，其中最典型的例子是對MyoD基因表達的調節。MyoD選擇性地在骨骼肌細胞表達，在非骨骼肌細胞中，DNA甲基化可以阻止MyoD的表達。實際上，去甲基化試劑能夠誘導非骨骼肌細胞表達MyoD，并向骨骼肌細胞進行轉化。此外，DNA甲基化可以聯合組蛋白乙酰化修飾共同控制骨骼肌的纖維類型。在肌肉再生過程中，肌衛星細胞的激活受到表觀遺傳調控[3]，但DNA甲基化在其中的作用機制有待于進一步研究。甲基敏感擴增多態性（Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP）是由擴增片段長度多態性技術（Amplified fragment length polymorphism,AFLP）改進后形成的，該方法使用甲基化敏感性內切酶代替AFLP中使用的內切酶，其余技術路線不變。本研究采用MSAP方法對五指山豬肌肉甲基化狀態進行研究，探討DNA甲基化在豬肌肉發育過程中的作用機制，為五指山豬基因組的甲基化研究積累數據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2017年10月16日至2018年11月22日在海南省農業科學院畜牧獸醫研究所進行。

1.2 試驗材料

選擇1月齡、2月齡、4月齡的五指山豬各3頭，采集背最長肌和半腱肌后利用基因組提取試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。9頭五指山豬全部來自海南國家級五指山豬保種場。

1.3 引物與接頭

引物與接頭（表1）的設計參考徐青等[4]所用的方法。引物與接頭由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 用于MSAP分析的引物與接頭序列

1.4 MSAP分析

MSAP分析包括4個主要部分：酶切反應、連接反應、擴增反應和產物檢測。對每份肌肉組織DNA樣本，分別用Eco RⅠ+MspⅠ和Eco RⅠ+HpaⅡ兩種組合進行酶切，連上接頭，分別用預擴增引物和選擇性擴增引物進行2輪擴增，設計選擇性引物組合10對進行第2輪擴增。

預擴增反應：反應總體系為25μL，其中連接產物1μL，EcoRⅠ和M-H預擴增引物各30 ng，dNTP 0.5μL（10 mmol/L），10×PCR buffer 2.5μL，鎂離子（Mg2+）2.0μL（25 mmol/L），Taq DNA聚合酶1μL（1 U/μL），加滅菌后的去離子水補足25μL。PCR程序為：94℃預熱4min；94℃變性40 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃延伸7min。

選擇性擴增反應：反應總體系為25μL，其中預擴增產物0.2μL，Eco RⅠ和M-H選擇性擴增引物各30 ng，dNTP 0.5μL（10 mmol/L），10×PCR buffer 2.5μL，Mg2+2.0μL（25 mmol/L），Taq DNA聚合酶1μL（1 U/μL），加滅菌后的去離子水至25μL。PCR程序為：94℃預熱4 min；94℃變性40 s，65℃（每個循環遞減0.7℃）退火30 s，72℃延伸60 s，共進行13個遞減循環；然后94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共23個循環；最后72℃延伸7 min。

PCR產物電泳及銀染：擴增后產物經4%聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色后，統計凝膠上各種模式的片段，詳細過程參考Xu等[5]所用的方法。

2 結果與分析

2.1 五指山豬肌肉組織基因組DNA檢測

通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的五指山豬肌肉組織基因組DNA（圖1），其片段大小均符合要求。采用微量紫外分光光度儀對DNA的OD值進行檢測，提取的18個肌肉組織基因組DNA，其OD值和濃度匯總于表2，所有DNA的A260/A280值都在1.8～2.0之間，從濃度上看，所有DNA樣品均可以用于后續的試驗。

表2 微量紫外分光光度儀檢測DNA結果

2.2 五指山豬肌肉組織甲基化分析

以10對選擇性引物分別擴增五指山豬背最長肌和半腱肌樣品，通過擴增出的多態性條帶數計算出樣品的甲基化率（表3）。1月齡五指山豬背最長肌的甲基化百分率介于42.37%～47.38%，平均為44.78%；2月齡五指山豬背最長肌的甲基化百分率介于39.00%～42.98%，平均為41.58%；4月齡五指山豬背最長肌的甲基化百分率介于36.32%～40.98%，平均為38.92%。1月齡、2月齡、4月齡五指山豬半腱肌的平均甲基化百分率分別是41.70%、39.39%、38.81%。

表3 五指山豬肌肉組織甲基化水平

3 討論

MSAP是在AFLP技術基礎上改進后應用于DNA甲基化研究的方法，MSAP用甲基敏感性內切酶HpaⅡ和MspⅠ代替AFLP的高頻內切酶MseⅠ處理基因組，并設計相應的接頭和引物，酶切后的基因組經擴增后，就會產生甲基化敏感的多態性譜帶。MSAP相對于其他檢測DNA甲基化程度的技術有3個主要優點：①不需要知道被測DNA的序列信息，在不同物種上具有通用性，可用于檢測基因組序列未知的生物；②敏感性強，只需要常規的儀器，操作相對簡便；③可在全基因組范圍檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化變化[6]。

肌肉組織學特性一般包括：肌纖維類型、肌纖維密度、肌纖維直徑、肌纖維面積、肌內脂肪含量等，這些因素都與肉質性狀緊密相關，并且相互之間也不是獨立的，其中肌纖維類型是聯系這些組織學特征的決定因素。肌纖維在出生后還會經過一個成熟的過程，這個過程主要涉及到肌纖維類型的轉變。早在20世紀70年代，人們已經開始根據不同酶組織化學染色法對骨骼肌進行分類。目前公認的分類方法是根據肌球蛋白重鏈的不同亞型將肌纖維分為4種類型：慢速氧化型肌纖維，即Ⅰ型肌纖維；快速氧化型，即Ⅱa型肌纖維；快速酵解型，即Ⅱb型肌纖維；中間型，即Ⅱx型肌纖維[7]。在本研究中，我們檢測了不同月齡五指山豬背最長肌和半腱肌的甲基化程度，背最長肌主要是Ⅱb型肌纖維，半腱肌主要是Ⅰ型肌纖維，兩種肌肉類型雖然不同，但在生長發育過程中，其平均甲基化率都成遞減趨勢。DNA甲基化和mRNA表達密切相關，通常認為高甲基化密度抑制基因表達，低甲基化密度促進基因表達，1月齡五指山豬背最長肌和半腱肌的平均甲基化率高于2月齡和4月齡，說明2月齡和4月齡肌肉發育相關基因表達比較活躍。

在中國的地方豬種資源中，小型豬品種主要有6個，分別是海南五指山豬、廣西巴馬香豬、云南版納微型豬、貴州香豬、甘肅蕨麻小型豬和藏豬[8]。小型豬作為重要的產肉動物和醫學實驗動物，在生產和科研上都具有重要價值。伴隨著后基因組時代的來臨，表觀遺傳學的研究已成為生命科學研究的熱點和發展前沿，下一步我們將對肌肉組織基因組DNA甲基化片段進行回收、克隆測序，并通過生物信息學分析，確定這些甲基化片段所屬的基因，期望發現與肉質性狀相關的功能基因，為更好地開展五指山豬遺傳改良提供新的思路并奠定基礎。

4 結論

在生長發育過程中，五指山豬背最長肌和半腱肌DNA甲基化處于動態變化中，兩種肌肉在1月齡時，其平均甲基化率均高于2月齡和4月齡。