SLC25A13基因突變與嬰兒膽汁淤積癥遺傳代謝病的關系

白丹

嬰兒肝內膽汁淤積癥屬于一種肝病，兒童是高發人群，發病率達1/2 500～1/5 000[1]。相關醫學研究表明，在中國遺傳代謝病中，陽性率位居首位的為甲基丙二酸尿癥，高危患者中陽性率位居第二位[2]。近年來新的診斷技術得到了飛速發展，但是現階段仍然缺乏確切發病原因的嬰兒肝內膽汁淤積癥占總數的70%左右[3]。本研究探討SLC25A13基因突變與嬰兒膽汁淤積癥遺傳代謝病的關系。

資料與方法

一、一般資料

隨機選取2016年8月至2018年8月四川省婦幼保健院嬰兒膽汁淤積癥患兒126例，將這些患兒作為研究組，另隨機選取同期我院年齡段相同、具有正常肝功能、無肝炎家族史的正常嬰兒100例作為對照組。

二、納入和排除標準

納入標準：(1)均在嬰兒期起病；(2)均為肝細胞性黃疸；(3)均有肝功能損害。排除標準：(1)膽道閉鎖；(2)梅毒螺旋體；(3)人類免疫缺陷病毒感染。

三、方法

(一)血串聯質譜分析 運用干血濾紙片法采集患兒全血標本，在專用采血濾紙(S&S903#)上滴入，晾干后送檢。用含氨基酸與酰基肉堿的甲醇萃取干血濾紙片，用鹽酸正丁醇衍生后將100 μL 80%已腈加入溶解，上樣檢測。采用美國生物應用系統公司生產的API200型串聯質譜儀、美國安捷倫公司生產的Agilent 1100型高效液相儀，采用ChemoView 1.2版本軟件(美國應用生物系統公司)進行定量分析。應用串聯質譜酰基肉堿血濾紙片(美國疾病控制和預防中心新生兒質控部門)，串聯質譜檢測的肉堿和氨基酸正常上限值取1 480例健康兒童的第99.8百分位，下限值取1 480例健康兒童的第0.002百分位，設定過程中嚴格依據美國CDC報告的參考值。

(二)尿氣相色譜質譜有機酸分析 將研究組患兒的5～10 mL新鮮尿液收集起來，將尿素酶加入到尿樣中，在37 ℃溫度下進行30 min的溫育，將氫氧化鈉、鹽酸羥胺、24酸、17烷酸、托品酸加入，混勻后在室溫下進行1 h的靜置，將鹽酸加入，離心將上清液分取出來，將乙酸乙酯加入，離心將上清液分取出來，然后將5 mL乙酸乙酯加入，將上清液分取出來。將無水硫酸加入，離心將水分除去，再次將上清液分取出來，在60 ℃的溫度下吹干，在此過程中將氮氣儀充分利用起來。最后將TMCS和BSTFA混合物加入，在80 ℃的溫度下進行30 min的衍生，向GCMS2QP 2010分析儀(日本島津)中移送。

(三)基因組DNA提取 清晨將患兒的2 mL空腹外周血抽取出來，EDTA抗凝，應用天根生物科技北京有限公司生產的DNA提取試劑盒將DNA提取出來。

(四)SLC25A13基因擴增 將亞洲人中最常見的12種SLC25A13基因突變選取出來，并對引物進行設計，由上海生工生物工程有限公司合成引物(見表1)。PCR反應體系為13 μL CWBIO Premix Tap+1 μL DNA模板+0.5 μmol/L上游引物+0.5 μmol/L下游引物+ddH2O=25 μL，具體擴增條件為：外顯子6、7、9、11、13、16、17均在94 ℃、94 ℃、72 ℃的溫度下進行3 min的預變性、30 s的變性、1 min的延伸，分別在55 ℃、56 ℃、62 ℃、50 ℃、57 ℃、60 ℃、54 ℃的溫度下退火，分別循環35次、35次、30次、40次、35次、35次、35次。

表1 PCR擴增SLC25A13外顯子的基因序列

(五)PCR-SSCP 在9 μL上樣緩沖液中加入3 μL PCR產物混勻，在98 ℃的溫度下進行10 min的變性后以較快的速度在散冰中放置5～10 min，室溫下在39∶1的非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行5～7 h電泳，分析聚丙烯酰胺凝膠的染色和顯色。用固定液浸泡電泳后的聚丙烯酰胺凝膠5～10 min，用含10%的無水乙醇+1%的冰醋酸+0.2%的AgNO3的染色液進行10 min銀染，用蒸餾水進行2次漂洗，將含3%無水NaOH的顯影液(將1 mL甲醛加入每200 mL溶液中)加入顯色，最后將顯色直接終止，在此過程中將蒸餾水直接利用起來。

(六)Citrin缺陷病基因測序分析 分析篩查研究組患兒的送檢尿氣相質譜、血串聯質譜，直接測序分析串聯質譜篩查懷疑為Citrin病的患兒，PCR-SSCP分析其余患兒，用ABI-PRISM3730測序分析PCR產物，比對SLC25A13基因正常序列(GenBank基因庫)和所得序列結果，將突變位點尋找出來，同時對PCR擴增出產物進行驗證，保證其為目的基因片段。直接測序PCR-SSCP未發現異常條帶的外顯子，從而對PCR擴增產物進行驗證，保證其為目的基因片段。

結 果

一、5例疑似為新生兒肝內膽汁淤積癥患兒的肝功能分析(見表2)。

二、5例考慮為Citrin缺陷病患兒血串聯質譜、尿氣相質譜分析

5例疑似為新生兒肝內膽汁淤積癥患兒的甲硫氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、C14-1、C16-1、苯乳酸-2、4-羥基苯乳酸均升高，1、3、4、5患兒的酪氨酸、C18-1、4-羥基苯丙酮酸均升高，1、2、3、5患兒的4-羥基苯乙酸-2均升高(見表3)。SSCP篩查其余嬰兒的7個外顯子PCR產物，7個外顯子均無異常條帶，測序均無相關的12種常見突變。

表2 5例疑似為新生兒肝內膽汁淤積癥患兒的肝功能分析

表3 5例考慮為Citrin缺陷病患兒血串聯質譜分析

討 論

相關研究表明[4]，在嬰兒肝內膽汁淤積癥的發病中，遺傳代謝發揮著一定作用。2001年篩查了日本嬰兒肝內膽汁淤積癥患兒的遺傳代謝病[5]，結果表明，其有SLC25A13基因突變存在。現階段臨床實踐證實，SLC25A13突變會引發兩大類常染色體隱性遺傳病，即檸檬素缺乏性新生兒肝內膽汁淤積癥、II型瓜氨酸血癥(CTLN2)[6-10]。本研究結果表明，5例疑似為新生兒肝內膽汁淤積癥患兒的甲硫氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、C14-1、C16-1、苯乳酸-2、4-羥基苯乳酸均升高，1、3、4、5患兒的酪氨酸、C18-1、4-羥基苯丙酮酸均升高，1、2、3、5患兒的4-羥基苯乙酸-2均升高。SSCP篩查其余嬰兒的7個外顯子PCR產物，7個外顯子均無異常條帶，測序均無相關的12種常見突變，和上述相關醫學研究結果一致。

總之，SLC25A13基因突變與嬰兒膽汁淤積癥遺傳代謝病無顯著關系，值得臨床重視。