軸突起始段與神經系統疾病研究

宋彬彬 楊 璇 甄 然 于 佳

神經元是神經系統最基本的結構和單位，高度極化，由胞體和較長的突起(軸突和樹突)構成。哺乳動物中樞神經系統神經元中在胞體-樹突區(somatodendritic domain)和軸突之間存在神經元動作電位啟始的特定部位，稱為軸突起始段(AIS)。AIS對于維持神經元極性和功能，建立完整的神經元回路非常重要[1]。本文主要對軸突起始段的結構、功能、可塑性及其相關神經系統疾病進行綜述。

一、軸突起始段的結構

AIS是起始于近胞體的軸丘(axon hillock)至髓鞘開始包繞為止的無髓鞘結構，長度為20～60μm，直徑為0.5～2.0μm。電鏡觀察到大鼠海馬CA3神經元AIS縱切面具有膜下致密層和微管束，且核糖體數量急劇下降。膜下致密層可分為3層，即7.5nm厚連接質膜的顆粒層、7.5nm厚中間層和35nm厚下層。微管束由5～8根微管形成，3～10根微管束易聚集，聚集的微管束間距約為40nm，且被蛋白質連接。橫切面觀察AIS可分為質膜、亞質膜和內部3部分，由支架蛋白(scaffolding protein)——ankyrin G(Ank G)連接。AIS質膜特異性富集多種離子通道和細胞黏附因子(cellular adhesion molecules，CAMs)等跨膜蛋白；亞膜區具有肌動蛋白(actin)和βⅣ血影蛋白(βⅣ spectrin)等重要的細胞骨架蛋白；內部主要分布神經纖維、微管束和肌動蛋白絲(actin filaments)[2]。肌動蛋白絲可形成環狀結構，沿軸突中心均勻分布，間隔為180～190nm，支撐細胞骨架。AIS特殊組成和結構對于其維持神經元結構和起始動作電位具有重要作用[3]。

Ank G是AIS中富集的早期定位蛋白，對于招募AIS相關蛋白和微管成束有重要作用。ankyrins N端具有Ank重復序列的膜結合域(membrane binding domain，MBD)，中間具有ZU5結構域、UPA結構域、神經元外顯子區域和“死亡域”(death domain，DD domain)，C端具有調節結構域。MBD可直接與鈉離子通道、鉀離子通道、神經束蛋白186(neurofascin-186，NF-186)和神經細胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule，NrCAM)結合[4]。ZU5結構域可與βⅣ spectrin結合。Ank G與不同蛋白質相互作用機制不同，磷酸化的鈉鉀離子通道與Ank G的親和力增加，而細胞黏附因子NrCAM和NF186通過FIGQY基序與Ank G結合，FIGQY基序中酪氨酸磷酸化會減弱其與Ank G的結合。Ank G S2417A突變使βⅣ spectrin在AIS定位明顯減少，但不會影響Ank G和NF186在AIS 聚集。而Ank G DAR999AAA突變雖可破壞Ank G ZU5結構域與βⅣ spectrin結合能力，但對βⅣ spectrin在軸突近端的聚集無顯著影響[5]。AIS中存在兩種肌動蛋白絲類型：短而穩定的肌動蛋白絲和長而不穩定的肌動蛋白絲。AIS中環狀結構主要由短而穩定的肌動蛋白絲末端被內收蛋白(adducin)加帽形成，通過βⅣ spectrin與NF186-Ank G-Nav復合物相連，主要作用于AIS選擇性屏障的形成。而長而不穩定的肌動蛋白絲可促進AIS膜下致密層重組[6]。Ank G也可通過微管正端示蹤蛋白EB1和EB3與微管相連，穩定微管晶格，促進微管成束[7]。AIS中微管成束是神經元極化的早期特征。微管束在AIS形成過程中可以捕獲AIS結構組分，并且選擇性透過胞質蛋白，對于AIS的結構和功能具有重要作用[8]。

二、AIS的功能

1.維持神經元極性：AIS對于維持軸突完整性和神經元極性具有重要作用[3]。研究發現，體外培養10天的海馬神經元軸突遠端(≥35μm)橫切后誘導軸突再生，不影響神經元極性。而軸突近端(<35μm)橫切后受損軸突中軸突標志物tau-1陰性，而樹突末端延長，且tau-1陽性，樹突標志物MAP2陰性，提示樹突轉變為軸突樣結構。這說明AIS是維持成熟神經元極性的重要部位[9]。AIS中Ank G 、βⅣ-spectrin和actin等形成特殊的細胞骨架可作為選擇性屏障，特異性允許軸突蛋白和脂質等通過，而屏蔽胞體和樹突內物質的進入。Petersen等[10]研究發現，體外培養的大鼠海馬神經元中，樹突囊泡可從胞體向軸突中運輸3～10μm，在AIS近側突然停止后返回胞體或與質膜融合，而軸突囊泡可勻速通過AIS進入軸突。藥物處理神經元使actin細胞骨架解聚可破壞AIS和蛋白質分選，使樹突囊泡進入軸突，且長距離順向運輸。另有研究發現，AIS中Ank G可招募動力蛋白(dynein)活性調節因子Lis1(lissencephaly 1)和NDEL1(nuclear distribution protein nudE-like 1)，從而激活dynein將胞體-樹突貨物從AIS逆行運輸回胞體[11]。

2.動作電位起始：AIS中聚集大量的鈉離子(Nav1.1、Nav1.2、Nav1.6)、鉀離子Kv1(Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4)、Kv2(Kv2.1、Kv2.2)、Kv7 (Kv7.2/KCNQ2、Kv7.3/KCNQ3)電壓門控通道，是調節神經元動作電位起始的重要結構。鈉離子通道中Nav1.6具有最低激活閾值，對動作電位起始具有主要作用。而Kv1 和Kv7可抵消鈉離子通道，抑制動作電位起始。Kv2被動作電位激活后可加速動作電位復極化，促進重復放電。AIS中也存在鈣離子電壓門控通道(Cav2.1、Cav2.2、Cav2.3、Cav3)，Cav2.3、Cav3可促進動作電位起始，而Cav2.1、Cav2.2抑制動作電位產生[12]。且AIS中離子通道組成具有細胞類型特異性和AIS分布特異性，鈉、鉀、鈣離子通道需協同調控動作電位的產生和傳播。另有研究發現，皮質和海馬神經元AIS遠端富集GABAA-α2受體，在細胞黏附因子NF186作用下可特異性與γ-氨基丁酸能(GABAergic) 中間神經元形成軸突-軸突突觸，負調控動作電位起始[13]。

三、 AIS結構和功能的可塑性及其調節

1.AIS具有結構和功能可塑性：神經元靜息狀態時AIS為相對靜態結構，AIS也可根據神經元活性變化調節AIS長度、定位和蛋白的表達，具有可塑性。研究發現，使用 KCl處理體外培養10～12天的海馬興奮性神經元3～48h后，使AIS向軸突遠端明顯移動，AIS長度下降25%，AIS中鈉離子通道蛋白和neurofascin等定位減少，且神經元興奮性下降，這說明AIS具有結構和功能可塑性[14]。且AIS長度和定位對神經元放電和興奮性具有特異性調節，當AIS距胞體較近時，AIS長度增加可提高軸突中鈉鉀離子電流傳導，增強神經元興奮性。而當AIS距胞體較遠時，AIS增長，神經元興奮性下降，這是由于隨著距離增加電荷損耗增大，AIS去極化受到抑制引起的[15]。AIS可塑性具有細胞類型依賴性：(1)15mmol/L KCl分別處理海馬CA1、CA3區神經元3h，只有CA3神經元中AIS長度明顯下降，且GABA+神經元AIS縮短不明顯[14]。(2)10mmol/L KCl處理體外培養11天的大鼠嗅球(olfactory bulb，OB)多巴胺能神經元24h后，AIS向胞體移動，且長度增加，這與興奮性神經元不同。當培養基中10mmol/L KCl更換為10mmol/L NaCl，5天后AIS可恢復到初始位置和長度[16]。

2.AIS可塑性調節：(1)磷酸酶和磷酸激酶調節：研究發現，海馬神經元中AIS移位依賴于L型鈣離子通道(L-type VGCCs)激活后鈣離子進入神經元，使鈣調磷酸酶(calcineurin)活化來觸發。藥物FK506處理海馬齒狀回顆粒細胞(dentate granule cell，DGC)抑制鈣調磷酸酶(calcineurin)的活性，可消除去極化引起的AIS位移[17]。而FK-506不能阻止多巴胺能神經元中去極化引起的AIS長度變化[16]。細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)廣泛參與調節神經元中AIS可塑性。使用藥物Roscovitine單獨處理DGC 6h，抑制CDK5活性，AIS可明顯縮短，且AIS長度與處理時間呈負相關[14]。Roscovitine處理多巴胺能神經元24h，可使AIS不依賴于KCl去極化向胞體移動，且AIS明顯縮短[16]。(2)肌球蛋白調節：肌球蛋白(myosin)是沿著肌動蛋白絲運動的分子馬達家族。Evans等[18]研究發現，肌球蛋白myosin Ⅱ參與調控活性依賴的AIS可塑性。體外培養10天的大鼠海馬神經元中，myosin Ⅱ活性抑制劑blebbistatin可完全抑制KCl去極化引起的AIS位移和縮短。進一步研究發現AIS中富集磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，pMLC)，pMLC可激活myosin Ⅱ的收縮活性，且與Ank G 共定位，可促進Ank G在AIS定位和AIS組裝。KCl誘導大鼠海馬神經元去極化5min，AIS中pMLC水平下降61%，30min時pMLC下降83%，Ank G下降35%，60min時Ank G和Nav蛋白表達水平下降約40%，這提示去極化時pMLC水平與AIS相關蛋白含量變化有關。隨機光學重建顯微法(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)檢測發現AIS中pMLC與肌動蛋白環(actin rings)共定位。actin穩定試劑可以完全抑制去極化引起的Ank G下降，緩解pMLC在AIS的減少，這提示actin異常是AIS分解的晚期事件。神經元去極化時pMLC水平下降使myosin Ⅱ收縮活性降低，引起actin不穩定，參與調節AIS結構可塑性[19]。(3)細胞分泌物調節：Guo等[20]研究指出神經元密度差異可能通過細胞分泌物的含量變化來調節AIS可塑性。體外實驗證實大鼠海馬神經元密度越小，AIS距胞體的距離越長，神經元興奮性降低。進一步研究發現腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和神經營養素(neurotrophin 3，NT3)可通過激活酪氨酸激酶受體TrkB(tyrosine kinase receptor B)和TrkC(tyrosine kinase receptor C)參與調節AIS移動，而神經生長因子不具有此功能。

四、AIS異常與神經系統疾病

AIS是維持神經元極性和功能的重要結構，多種神經系統疾病中AIS發生異常改變，而AIS相關蛋白突變或可塑性受損也可引起癲癇、腦卒中、認知功能障礙和運動神經元病等多種神經系統相關疾病。

1．癲癇：癲癇(epileptic)是由多種原因引起的一種慢性腦功能障礙疾病。離子通道結構和功能改變對癲癇的發生有密切作用。Nav1.6(由SCN8A編碼)高度富集于哺乳動物中樞神經系統神經元的AIS。Nav1.6 參與調控動作電位起始，也可通過調節持續鈉電流影響神經元興奮性。 Nav1.6由6個跨膜結構域和胞質N端、C端結構域組成，Nav1.6致病突變(Arg1617 和Arg1872)主要位于其C端，可使鈉離子通道失活受損，神經元過度興奮，引起早期嬰兒型癲癇性腦病[21]。Nav1.6 發揮正常功能與其定位相關，Nav1.6 N端可與微管結合蛋白MAP1B相結合，而N端突變可使二者結合受損，導致Nav1.6在AIS定位減少，使持續性鈉電流異常增大，從而與疾病相關[22]。

2.腦卒中：研究發現，腦卒中引起缺血性壞死中心神經元中AIS細胞骨架蛋白發生快速、不可逆的鈣蛋白酶(calpain)依賴性水解[23]。缺血性腦損傷小鼠模型大腦中動脈閉塞6h后，皮質神經元發生明顯的鈣離子依賴性鈣蛋白酶calpain激活，引起AIS中βⅣ spectrin、Ank G 和Nav特異性水解。體外培養的海馬神經元糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation )2h后，AIS中βⅣ spectrin 染色強度顯著下降，且可持續8～10天，使AIS組成發生不可逆損傷，破壞神經元極性[24]。

3.阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)：DNA甲基化異常與AD發生相關。Sanchez-Mut等[25]利用AD患者尸檢皮質樣本和小鼠模型研究發現Spnb4(spectrin beta 4)基因高度甲基化。而Spnb4基因編碼的SPTBN4蛋白可與Ank G結合，SPTBN4突變或異?？赡芡ㄟ^與Ank G結合受損而抑制動作電位起始，改變神經元興奮性。而且AD神經元中AIS完整可維持tau在軸突定位，負調控tau錯位積聚。Sun等[26]研究發現，與野生型小鼠比較，AD小鼠海馬組織中neurofascin蛋白水平下降50%，海馬神經元中Nav 1.6分布于整個軸突，且AIS中水平下降。野生型小鼠海馬神經元中只有小分子蛋白(10kDa和27kDa)可進入軸突，而大分子蛋白(90kDa)不能進入軸突。而AD小鼠模型中，大分子和小分子均可進入軸突，提示AIS胞質屏障功能受損。Ank G缺失純合小鼠表現出明顯運動缺陷和認知功能障礙[5]。

4.額顳癡呆(frontotemporal dementia，FTD)：微管結合蛋白tau參與維持AIS結構和功能。tau異?？善茐腁IS中Ank G和微管的穩定性，改變AIS定位。tau蛋白病-FTD與神經網絡異常興奮有關，而AIS結構和可塑性對于調控神經元興奮性至關重要。最新研究發現，FTD患者多能干細胞衍生的神經元中， FTD致病突變tau V337M 通過使EB3在AIS異常積累，EB3與Ank G共定位增加，從而破壞AIS可塑性，使神經元異常興奮。

5.運動神經元病：早期研究發現，肌萎縮側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者和小鼠模型脊髓前角神經元AIS中滑面內質網、線粒體、溶酶體、神經纖維等積累，軸突運輸障礙，AIS腫脹，直徑明顯增加，且這種變化出現于運動神經元病早期。

6.其他：全基因組關聯分析(genome-wide association study，GWAS)研究發現Ank G編碼基因ANK3是雙相情感障礙(bipolar disorder，BP)高風險因子。精神分裂癥(schizophrenia)患者腦組織尸檢發現皮質表層椎體神經元AIS中Ank G表達下降15%～20%，AIS長度無明顯變化。多發性硬化癥(multiple sclerosis，MS)患者血清樣本中NF186含量明顯增加。2型糖尿病小鼠模型前葉皮質和海馬神經元中AIS顯著縮短。皮質興奮性神經元AIS可與皮質小膠質細胞相連，而當腦損傷小膠質細胞被激活后，與小膠質細胞相連的AIS數量減少。

五、展 望

綜上所述，AIS是富集Ank G、βⅣ spectrin、細胞黏附因子和離子電壓門控通道等多種組分的特殊軸突起始部位，具有維持神經元極性和動作電位起始功能。AIS具有結構和功能可塑性，且AIS可塑性受到磷酸酶和磷酸激酶、肌球蛋白、細胞分泌物等調節。在多種神經系統疾病中，AIS組成蛋白或結構明顯發生異常改變，這與神經元活性受損緊密相關，故AIS可能作為疾病防治的重要靶標。但AIS組成和病理變化復雜，具有細胞類型依賴性，且多種蛋白質間通過不同機制相互作用共同調控疾病進程。因此AIS在生理、病理條件下的可塑性變化和機制，及其與疾病的關系亟需深入研究。