碳同位素自然豐度分析在土壤生態系統碳動態研究中應用

姜懿珊 ，羅春玲，張干*

1.中國科學院廣州地球化學研究所/有機地球化學國家重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.中國科學院大學，北京 110049

過去 50年來，人類因素和自然因素排放的溫室氣體排放驅動全球氣候變暖已經成為全球廣泛關注的共識。為了限制二氧化碳氣體的排放，人們先后在1997年和2009年聯合國氣候氣候變化框架公約大會上簽訂了《京都議定書》和《2009哥本哈根協議》。有關大氣二氧化碳源、匯的問題，全球氣候變化碳循環中，大氣中實際的碳增量、海洋吸收碳的總增量和化石燃燒釋放碳的增量都相對容易測定，而多樣的陸地生態系統類型，較大的碳循環時空變異，以及當前薄弱的陸地生態系統碳循環研究（Bazzaz，1990；Koch et al.，1996），導致陸地生物圈中的土壤很可能是碳收支平衡中的一個“未知匯”。全球土壤中具有豐富多樣性的生物和有機質，共同組成了一個巨大的碳庫，因此成為重要的潛在溫室氣體的“源”和“匯”（Torn et al.，2009）。全球土壤有機碳（1 m深范圍內）達到1500—2500 Pg C（Berg et al.，1993；IPCC，2000），約為全球陸地總碳量的三分之二，是大氣層總碳量的2倍，植被碳庫的 4倍。土壤與大氣之間的碳交換量達 C 60 Pg·a-1，是全球化石燃料釋放量的10倍（Fernandez et al.，1993）。森林和草地土壤約占全球土壤碳儲量的39%和15%（Berg et al.，1993），是碳排放和碳固定的重要載體（IPCC，2000；Trumbore，2009）。因此，自然生態系統中土壤碳庫的動態研究在全球陸地生態系統碳循環中占有重要地位。這些生態系統存在于從熱帶到寒帶，平原到高原等多樣的氣候條件和生態環境當中，同時包含了對應的復雜多變的植被類型（Veresoglou et al.，2019；Wang et al.，2019）。越來越多的證據表明，自然生態系統中土壤有機碳庫在頻繁的人類活動干預和劇烈的氣候條件變化下，越來越容易受到攻擊和影響（Jin et al.，2019）。如大范圍的森林砍伐導致馬來西亞在過去的29年來土壤有機碳儲量下降42%，印度東北部地區土壤有機碳密度顯著降低（Lungmuana et al.，2018；Rahman et al.，2018）。同樣的，過度開發，如草場過度放牧，導致青藏高原草地和溫帶草原土壤有機碳儲量分別下降了26.5%（Li，2016）和33%（Xu et al.，2013）。自然生態系統中土壤有機碳相對微小的動態變化，都將導致整個土壤層有機碳庫絕對量的巨大變化，繼而引起與大氣碳交換加劇，最終與全球氣候變化產生交互影響。要預測和了解這些生態系統中土壤有機碳庫對未來環境變化的響應，則需進一步完善對土壤有機碳循環核心成分碳動態的探索。在此過程中，碳同位素自然豐度由于其在自然生態系統中天然的示蹤作用，成為研究土壤碳動態的新焦點。

1 碳同位素自然豐度分析在土壤碳動態研究中的指示意義

已有的土壤表層有機碳的14C年齡、土壤有機碳含量變化和土壤有機碳13C自然豐度分布特征已經表明土壤碳庫是由至少3個具有不同更新周期的亞碳庫組成（Townsend et al.，1995；Trumbore et al.，1989；沈承德等，2000）：活動碳庫（根分泌物和快速分解的植物殘體，更新周期小于1年）、易分解碳庫（更新周期在數年至數百年之間）和穩定碳庫（礦化有機碳，更新周期大于千年）（Trumbore et al.，1997；陳慶強，1998）。在自然生態系統中，土壤有機質作為一種持續接受植物新碳輸入和承受降解作用碳損失的碳庫，其自然14C/12C同時反映了放射性衰變和降解衰變（Torn et al.，2009；Trumbore，2000）。如何確定土壤有機碳在不同庫中的分布及駐留時間，是運用這種區分的前提。土壤有機碳包含土壤微生物量碳以及土壤有機碳組分在內的一系列核心成分（Trumbore，2009），它們具有不同的物理化學屬性和周轉時間，所以傳統的土壤普查方法，如土壤有機碳的組成、含量、土壤呼吸碳排放量等，很難精準的探測到幾年或幾十年內環境變化對土壤碳動態的影響（Del Galdo et al.，2003；Paul et al.，2002）。碳同位素測量方法，是目前唯一可以直接揭示土壤碳循環的擾動和恢復過程（De Camargo et al.，1999）中土壤有機碳庫動態的研究方法。土壤有機碳的放射性同位素（14C）可用來確定碳動態變化以及全球變化對土壤碳的影響，并能用于檢驗土壤碳動力學模型的預測效果（Trumbore，2009）。

過去由于碳同位素自然豐度檢測條件不成熟，研究人員更多地應用人工控制添加穩定碳同位素（13C）開展實驗設計，成功有效地在應用在有機碳循環機制的研究中（Chunmei et al.，2020；宋斗妍等，2008）。而相比于實驗室培養無法完全模擬自然環境的劣勢，利用碳同位素自然豐度示蹤更能真實反映自然生態系統中土壤碳動態的變化。近年來，隨著分析技術的發展，尤其是加速器質譜技術的出現，使檢測單體化合物（如生物標志物PLFA）中低濃度的14C自然豐度也得以實現（Carbone et al.，2010；Czimczik et al.，2005；Hanson et al.，2005）。這使13C和14C同位素自然豐度分析方法成為研究不同時間尺度自然生態系統中土壤有機碳動態的一個強有力的工具。其中，土壤有機碳的穩定碳同位素（13C）的自然豐度綜合了幾年到數十年尺度植被的同位素信息，成為評價生物碳同位素組成變化的最佳觀測指標（Bird et al.，2004）。1950—1960年代進行的核試驗所釋放的14C使大氣14C水平上升了約1000%并由大氣沉降作用逐年下降。在此過程中，14C水平成為了天然地示蹤因子，明確地區分出高14C水平代表的新土壤有機質和低14C水平代表的老土壤有機質。計算大氣14C與不同周轉速率土壤組分耦合后的14C水平，便可以清楚地評估這一地區土壤有機碳的周轉狀態（Harkness et al.，1986；Trumbore et al.，1989）。

2 微生物 PLFA的碳同位素自然豐度分析技術

生態系統固定CO2的能力主要依賴于它們固定碳產物的產量和保持碳的時間（Fung et al.，1997），而土壤微生物是將CO2轉化為土壤有機質的核心動力（Torn et al.，2009）。土壤有機質由一系列不同周轉時間的組分組成，通過這些組分的碳同位素水平可以直接反映環境因素對土壤碳組分動態變化的影響程度。比如在土地改用以后，通過碳同位素水平估計新植被類型輸入后對土壤有機質造成的影響，計算舊植被殘體及保留時間的指數式衰減（Gleixner et al.，1999）。有科學家通過土壤穩定同位素（13C）水平檢測，發現在植被改變23年后土壤主體中糖和蛋白質的13C水平才開始減少（Gleixner et al.，2002）。由此可見，土壤有機質并不都能很快的從同位素水平反映出環境條件的變化。然而，土壤有機質的不穩定性和易降解性，使得微生物得以對新老有機碳進行利用并快速循環（Gleixner et al.，2005），但在討論生態系統對全球環境變化的響應時，它經常被忽略（Jennifer et al.，2020）。生物通過光合作用固碳、再通過呼吸作用或降解作用，將一部分碳返還給大氣的平均周轉時間，是評價生態系統在外界環境變化（如氣候變化）下，碳儲存和釋放改變時間和改變程度的重要評價指標（Thompson et al.，1996）。而通過對土壤有機碳組分和微生物量碳同位素水平的綜合評估，可以進一步生態系統中土壤碳庫動態變化以及不同微生物的碳周轉特性進行評價。

目前利用碳同位素技術研究微生物量碳動態主要通過活體土壤微生物標志物磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acids，PLFAs）來實現。PLFA是微生物細胞膜的主要組成成分，具有比較穩定的化學性質，不容易在提取過程中喪失或轉化（Frosteg?rd et al.，1991）。由于不同微生物細胞膜脂類結構的差異，不同PLFA可以對來對不同的功能微生物進行識別。如亞麻油酸（C18:2ω2）可用作真菌的標記物，β-OHFA則用作革蘭氏陰性細菌的標記物（Zelles，1999）。細胞死亡后微生物細胞膜最多一周之內便會被水解，因此，PLFAs可以作為理想的研究微生物活細胞群體的生物標記物。活體微生物細胞膜中的磷脂通常有著與微生物碳源直接相關的碳同位素指紋特征（Boschker et al.，2002）。這已經廣泛用于在實驗室培養的13C添加實驗研究中指示土壤微生物的碳源（Abraham et al.，1998；Hanson et al.，1999）。而14C自然豐度分析作為一種可以精準測量微生物群落脂類14C水平的手段，與PLFAs方法相結合，可以更加準確的獲得微生物的碳源以及碳周轉速率的信息。例如，通過土壤中PLFA的14C含量的差異，可以評估石油污染地區，微生物的修復作用，即微生物否以污染物為碳源（Ahad et al.，2013；Cowie et al.，2010；Mahmoudi et al.，2013；Mills et al.，2013；Slater et al.，2006；Slater et al.，2005）。在環境科學標準參考物質的研究進展中，PLFA的單體碳同位素自然豐度分析（Compound specific radio carbon analysis，CSRA），在配備加速質譜（accelerator MS，AMS）后得以實現，使自然生態系統中特定微生物量碳動態信息可以被直接指示和收集（Cowie et al.，2010；Eglinton et al.，1997；Li et al.，2012；Uchikawa et al.，2008）。

3 碳同位素自然豐度分析在土壤碳動態研究中的應用

3.1 土壤有機碳動態

過去幾十年的研究已經較清楚的顯示了土壤有機質固定的機制和時間問題，然而對其過程，我們卻缺乏足夠的了解，因此要預測土壤有機碳在不同土壤類型、地貌和一定的氣候和環境條件變化下的響應存在很大的不確定性（Trumbore，2009）。部分原因在于過去的研究多集中在小范圍的、短時間尺度上的土壤碳平衡過程。例如，過去的土壤碳模型研究多集中于土壤表層20 cm（Jenkinson et al.，1977；Parton et al.，1987），而事實上，較大部分的土壤有機碳是儲存在地表 20 cm以下的土壤中（Jobbágy et al.，2000），相應地，評估這部分是否高度穩定對于研究土壤動態來說非常重要（Kramer et al.，2008；Rethemeyer et al.，2005）。因此，要了解區域性土壤有機碳的動力學過程，長時間尺度地和大范圍的研究十分重要。

對于那些有明確記錄的植被類型變化的生態系統（通常是C3植被改種C4植被），新舊植被光合產物對土壤投入13C水平的差異，可以在幾十年時間范圍內通過土壤有機質13C的變化速率反映出來（Balesdent et al.，1987）。土壤有機碳13C的自然豐度在土壤剖面中的分布和富集也可以在一定程度上反映生態系統中環境變化對土壤碳庫的影響（于貴瑞等，2005）。這種方法在碳動態研究中提供了許多重要的證據，然而對于確定的、單獨自然因素改變的需要使得其不能被廣泛應用于自然土壤生態系統當中，也不能可靠地反映千年時間范圍內的碳動態研究。

14C有效地彌補了13C在時間范圍上的限制，是目前唯一可以解決土壤有機碳較長時間尺度，十年至千年尺度動力學過程的工具（Levin et al.，2000）。14C作為良好的示蹤劑且直接與碳本身相關，早在1960s末就用作標記物用于土壤腐殖質的研究（Campbell et al.，1967）。而隨著對核爆14C認識的加深，核爆14C作為理想的示蹤劑且在各生態系統廣泛存在，自1970s末開始廣泛應用于揭示土壤有機碳碳庫大小、碳輸入率和更新方面（O'Brien et al.，1978；Trumbore，1993）。

為了預測土壤有機碳在長時間尺度上的變化，有關土壤有機碳14C的模型研究是研究土壤有機碳動力學研究的重點之一。但目前有關研究中可以矯正模型的野外實測土壤有機碳組分14C自然豐度數據仍然較少（Wang et al.，2002）。隨著近年來全球土壤有機碳的14C數據庫的完善，研究人員在應用實測土壤有機碳的14C數據對 global land model（ELMv1-ECA）和Earth System Model（E3SM）模型的預估進行統計對比發現，深層土壤有機碳的碳周轉被嚴重低估了（Chen et al.，2019）。大部分土壤有機質14C研究應用于單個土壤剖面中，將這些點擴散到面需要一個可以在多維角度預測這些因素對碳儲量和碳動態變化的框架設計。目前比較認同的框架設計是state factor方法（Amundson et al.，1997；Torn et al.，2009）：將可測量的土壤性質（如有機質含量）與state factor聯系起來，包括氣候，植被，基質，地形和時間。Amundson & Jenny在1997年又基于人類對地表塑造的巨大影響增加了第6種state factor：人類活動。這個框架的價值在于，在開展研究過程中，我們可以在取樣時縮小其它 state factor差距，再分離研究其中某種state factor的影響。基于以上理論，土壤有機碳組分的14C的自然豐度分析可以從以下幾個方面用于定量研究土壤碳動態過程：

（1）測算土壤中某恒定物質的碳年齡。如果碳自進入土壤中一直沒有與土壤環境中其它的碳進行交換，那么我們就可以通過測試土壤有機碳的14C年齡，來判斷土壤有機碳形成的時間（Trumbore et al.，1997；沈承德等，2000）。那些公元1960年以前固定的碳，放射性碳同位素測算要進行大氣14C波動校正。這種波動校正的精密度有限，因此14C在區分公元前1650至公元1950年固定的碳年齡時，可能不是十分準確。但是對于自1960以來形成的土壤有機碳14C年齡誤差可減少到1—2年。這種手段也可以應用于燒焦的樣品材料（Pessenda et al.，2001）或指認未完全分解的有機質殘片中（Trumbore et al.，1997），因為在這部分土壤的有機碳中可能有未分解的碳化物質或可識別的植物殘體。

（2）指示土壤碳庫與大氣碳庫之間的碳交換速率。土壤是一個開放系統，新鮮土壤有機質源源不斷地從這個系統中進出。1960年以前的有機質的14C水平可以推測其對大氣14C的平均分解速率（Torn et al.，1997）。核試驗所產生14C的加入使14C水平變為示蹤近幾年、幾十年甚至幾百年土壤地氣交換的一個更靈敏的示蹤因子，從而估算土壤有機碳平均的分解速率（Agnelli et al.，2010）。14C所反映出的時間是大氣碳原子通過植物固定后開始計算的，因此并不需要進行植物分解速率的直接測量就可以獲得它們對大氣有機碳降解速率的信息。通過土壤有機碳組分的14C自然豐度分析，可以對自然生態系統中土壤有機碳的周轉速率進行評估，從而評價土壤碳循環中重點關注的溫度等氣候影響因素的影響（Jinquan et al.，2020）。

（3）示蹤物質來源。例如比較不同土壤呼吸二氧化碳或土壤中二氧化碳氣體與其潛在來源的碳同位素值來分析哪種基質作為碳源，判斷其主要來源（Trumbore，2006）。這雖然通過生態學觀測的方法也能取得，但往往存在較大的不確定性（Hanson et al.，2000）。例如，研究人員通過對比鼎湖山森林土壤中有植被覆蓋和沒有植被與根系分布情況下二氧化碳氣體來源比例后指出，微生物分解作用可能是土壤二氧化碳氣體的主要來源，但是由于兩者并非同一剖面，因此結果存在不確定性（Yi et al.，2007）。運用碳同位素方法，丁平等發現在同一片林區和時期（雨季）植被覆蓋程度不同，差異非常大，植被茂密的剖面土壤二氧化碳氣體主要來源于根系呼吸（80%），而植被稀疏的剖面土壤二氧化碳氣體主要來源于微生物分解作用（68%），深部土壤中的二氧化碳主要來源于表層 0—20 cm土壤有機碳的分解（丁平等，2010）。近期針對森林改種土壤中土壤有機碳動態的研究發現，表層30 cm土壤有機碳的碳動態明顯受到植被轉換的影響，而深層土壤有機碳變化不明顯（Jiang et al.，2020）。

3.2 土壤微生物量碳動態

PLFA的13C示蹤已廣泛應用于實驗室培養實驗中微生物對外源添加物的代謝特性研究中，包括有毒底物、有機物料以及葡萄糖碳等等（宋斗妍等，2008）。而PLFA單體的13C自然豐度目前最直接的指示意義就是可以區分不同微生物的植物碳源是來自C3或C4植被，因此通常被用于C3—C4植被演替下耕作土壤微生物的研究中，用于指示短期內植被改變后不同微生物對植物碳代謝的變化（Balesdent et al.，1987；Boschker et al.，1998；Kramer et al.，2006）。如 Kramer et al.（2006）在對兩個經歷了植被演替的農田土壤中PLFA的13C的自然偏移程度調查后發現，40%—90%的微生物碳源在作物變化后發生了改變，微生物更多的利用新植被作為碳源。而由于野外土壤生態系統中植被演替時間尺度較大，生物標志物的13C自然豐度示蹤受限于其比較窄的變化范圍（Faure，1978），必然不能對微生物量碳動態予以很好的指示變化。相反的，土壤PLFA單體的14C的自然豐度分布特征，可以表征長時間尺度以及在大范圍空間內比較微生物新老碳源，并在平衡態生態系統中估算不同微生物量碳的周轉速率（Yevdokimov et al.，2013）。如同樣在 C3—C4植被演替系統的研究中，Kramer et al.（2006）對土壤微生物單體PLFA的測定不僅發現植被更替后微生物在植物碳源利用中的轉變，還發現微生物對變化尺度較大的土壤有機碳中新碳的利用率為0—40%。此外，格蘭仕陽性菌與陰性菌對植物碳和土壤碳的優先利用狀態相反。目前，利用PLFA單體14C的自然豐度指示土壤微生物量碳動態的研究在國內外還未普及，主要由于單體 PLFA的14C測定所需苛刻的前處理技術和加速器質譜高昂的測定費用限制所導致。從個別已有的利用單體PLFA的14C自然豐度分析在土壤生態系統中開展的研究來看，對大尺度時間范圍內的微生物量碳動態的監測（Kramer et al.，2010）以及在大空間范圍內極端生態環境中微生物量碳動態的比較（Rethemeyer et al.，2005）都已經得到了很好的應用。利用單體PLFA的14C自然豐度分析，可以對自然環境中影響微生物量碳代謝的影響因素進行佐證，如土壤的凍結狀態所影響的表層微生物量輸入、微生物活性等（Hagedorn et al.，2019）；也可以探索不同生態系統中微生物量碳的碳源，如微生物是可以利用淺層沉積基巖中相對老的碳源等（Schwab et al.，2019）。

4 結語

碳同位素自然豐度分析是隨儀器分析技術的進步，順應人類歷史發展造就環境優勢所發展起來的新技術，將成為土壤生態系統中碳動態研究的有利工具。近年來隨著大氣中過量的核爆14C的濃度的下降，14C自然豐度在生態系統中作為幾十年尺度時間范圍內碳源的天然示蹤因子會逐漸失效，應抓住機遇盡早開展研究。目前已有的應用碳同位素自然豐度分析對土壤碳動態的研究仍停留在局部地區，且主要針對表層10 cm左右的土壤，深層土壤有機碳的14C數據仍嚴重缺乏（He et al.，2016）。因此，未來研究中應利用碳同位素自然豐度在環境變化中指示靈敏的優勢，在大尺度時間和空間范圍內開展土壤碳動態的研究，尤其是針對認識缺乏的深層土壤碳動態開展長期生態學實驗研究。