輔酶Q10生物合成代謝調控策略研究進展

杜家文，黃建忠，江賢章

（福建師范大學工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心，福建師范大學生命科學學院，福建福州 350117）

輔酶Qn（CoQn），也叫泛醌（Ubiquinone），是一類脂溶性醌類化合物，具有很強的抗氧化能力；由一個醌環與不同數目的異戊烯側鏈組成，其苯醌結構可以可逆地還原為對苯二酚化合物，是呼吸鏈中的氫傳遞體。側鏈異戊烯的個數（n）決定了輔酶Qn的種類。人體中，輔酶Q10是參與線粒體內膜呼吸鏈電子傳遞的重要組分，在降低自由基傷害、改善心肌細胞、預防心血管疾病中起到重要作用[1]。本文根據近年來國內外關于微生物輔酶Q10代謝調控策略進行綜合論述。

1 誘變篩選

化學誘變是微生物育種的重要手段，將輔酶Q10的生產菌株進行化學誘變后，在加有輔酶Q10合成途徑抑制劑或呼吸鏈電子傳遞抑制劑的培養基中進行篩選，可以選育出輔酶Q10的高產菌株。例如，將根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）化學誘變后，分別涂布至加有道諾霉素和甲萘醌（輔酶Q10結構類似物）、L-乙硫氨酸（甲硫氨酸前體類似物）、芳香族氨基酸合成以及電子傳遞鏈抑制劑的平板上，成功獲得了高產Q10的根癌土壤桿菌[2]。另外，在可以產生胡蘿卜素的輔酶Q10生產菌株中，有研究發現胡蘿卜素產量的降低可以導致輔酶Q10產量的升高。其原因可能是胡蘿卜素降低后，細胞內需要合成更多的輔酶Q10來增加細胞的抗氧化能力，免受自由基的傷害；也可能是胡蘿卜素降低使得兩者共同的中間體異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）被更多地用于合成輔酶Q10。

2 增加輔酶Q10的前體

2.1 增加異戊烯前體

增加異戊烯前體是提高輔酶Q10的有效手段。大腸桿菌中通過強化表達2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）合成途徑上的關鍵限速酶[2]基因可以有效提高其輔酶Q10的生產水平。MEP途徑的第一步是由1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（DXP合成酶）催化3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸縮合生成DXP的反應。有研究報道在可以合成胡蘿卜素、番茄紅素的轉基因大腸桿菌中，增加DXP合成酶基因的表達水平，可有有效提高胡蘿卜素、番茄紅素的產量[3]。使用同樣的策略在可以合成輔酶Q10的轉基因大腸桿菌中，過表達來源于假單胞菌綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的DXP合成酶基因，使輔酶Q10的產量比對照菌株提高了1.8倍[4]。

2.2 增加芳香環前體

在細胞中提高芳香環前體的供應是提高輔酶Q10產量的另一有效方法。由分支酸途徑合成的對羥基苯甲酸（pHBA）是輔酶Q10的母核，分支酸裂合酶（UbiC）是將分支酸轉化為pHBA的酶。除了轉化為pHBA，分支酸還是細胞體內合成苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、葉酸、維生素K2等化合物的前體物質。因此細胞內UbiC酶的含量決定了分支酸代謝的走向。產輔酶Q10的轉基因大腸桿菌中，在過表達多聚異戊烯轉移酶（UbiA）的同時，增加UbiC的表達量可以有效增加輔酶Q10的產量[5]。在鎖擲酵母（S.johnsonii）的研究中發現，在培養基中添加pHBA即可使其輔酶Q10產量提高8倍[6]。然而，體外添加pHBA對大腸桿菌輔酶Q10的產量卻幾乎沒有影響[7]。以上研究表明，在異戊烯前體供應充足的前提下，通過提高UbiA的表達水平，或者提高細胞對pHBA的攝取量可以使分支酸的代謝流向輔酶Q10合成方向，從而增加輔酶Q10的產量。

2.3 過表達泛醌修飾途徑基因

在可產生輔酶Q10的重組大腸桿菌中，由泛醌修飾途徑上的基因UbiA催化的多聚異戊烯側鏈與pHBA之間的縮合反應是合成輔酶Q10的關鍵限速步驟[2]。與僅僅過表達十聚異戊烯焦磷酸合成酶（DPS）的大腸菌株相比，共同過表達UbiA與DPS的菌株中，輔酶Q10產量提高了3.4倍[5]。然而，在大腸桿菌中過表達其他泛醌修飾途徑上的基因UbiB、UbiG及單加氧酶(UbiH)，對輔酶Q10產量并沒有顯著影響[5]，這可能是pHBA或異戊烯前體供應不足所致。

3 調控中心代謝提高輔酶Q10產量

與輔酶Q10一樣，番茄紅素合成的前提物質也是異戊二烯。有研究發現，通過中心代謝調控，使碳代謝流轉向番茄紅素合成途徑，可以在重組大腸桿菌中顯著提高番茄紅素的產量[7]，同樣的策略也可應用于增加輔酶Q10的合成。另一種策略是通過平衡中心代謝的還原力來增加輔酶Q10的合成量。例如，研究表明在根瘤菌R.radiobacter中，NADH/NAD+比例的升高是其高產輔酶Q10的重要原因[8]，基于這一發現，通過過表達NAD+依賴的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GapA），使NADH/NAD+的比例提高25%，可以成功將輔酶Q10的產量提高2倍[8]。

4 優化培養條件提高輔酶Q10產量

許多研究表明，發酵過程中降低培養基中的溶氧濃度，可以提高R.radiobacter和R.sphaeroides的輔酶Q10產量[9]，例如將溶氧由20%降到5%，R.radiobater的輔酶Q10產量提高了4倍[10]。為了研究這一現象背后的機制，人們利用細胞色素c氧化酶的抑制劑疊氮化合物和解偶聯氧化磷酸化試劑（2,4-二硝基酚，DNP）對細胞進行處理，結果發現隨著培養基中疊氮鈉濃度的升高，輔酶Q10濃度也隨著升高。然而，DNP對輔酶Q10的積累并沒有效果，這一結果表明降低氧供應引起的Q10產量提高的原因并不是由于細胞質子梯度變化，而是限氧本身引起。

5 展望

迄今為止，通過誘變和選擇抑制劑分離菌株已被證實是提高輔酶Q10產量的最成功策略。但是，由于選擇抑制劑培養基上篩選的菌株與輔酶Q10產量之間沒有直接的關系，運用這種方法很難再進一步提高輔酶Q10產量。通過對自然界中高產輔酶Q10的菌株進行對比分析，可能會得到有價值的線索，并應用于基因工程菌株的改造。