PCR技術在植物生物學中的應用研究

張寶華

（朔州師范高等專科學校，山西朔州 036000）

1 PCR技術原理

PCR指的是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction），而PCR技術就是一種將待檢驗的DNA序列于生物體細胞外在酶促作用下進行擴增的技術方法。對于PCR技術，主要由3個反復循環的步驟構成，也就是高溫變性、低溫退火以及適溫延伸，然后在TaqDAN聚合酶這種特異的耐熱酶的催化作用下完成。對于PCR技術的基本原理，是將寡聚核苷酸引物與模板DNA分子結合，然后進行特異核苷酸序列的擴增。

2 PCR技術的主要分類

2.1 多重PCR技術

多重PCR技術是在普通PCR技術的基礎上發展起來的，對于多重PCR技術的原理，和PCR技術大致相同，是加入兩對及以上的特異性引物在同一個PCR反應體系中，而由于引物能夠特異性結合模板DNA，所以在同一模板不同區的多個目的或是多個模板的NDA片段能夠擴增出來。對于多重PCR技術，具有低成本、高效率、簡單省時等優點，在其基于引物篩選的基礎上需要多次優化反應體系和反應條件。

2.2 單分子PCR技術

單分子PCR技術是以單個或者是少量的DNA分子作為模板進行的PCR反應。和傳統的PCR技術相比，單分子PCR技術的基本循環過程相同，只不過在模板數量、引物設計、反應條件以及DNA聚合酶的選擇等方面，單分子PCR技術與傳統PCR技術都不相同。

2.3 實時熒光定量PCR技術

所謂的實時熒光定量PCR技術，是在傳統PCR技術的基礎上融合核酸擴增、雜交、實時檢測以及光譜分析等技術，因此具有準確性高以及實時性的特點。對于PCR技術的研究，實時熒光定量PCR技術是從定性到定量的飛躍。實時熒光定量PCR技術是由美國PE公司于1995年研制成功的，然后將其應用到了植物生物學、分子生物學等各個領域。

3 PCR技術在植物生物學中的應用

3.1 PCR技術在植物抗病基因檢測中的應用

隨著社會的不斷進步，科學技術的不斷發展，人們對于植物抗性基因的檢測越來越關注，而對于基因的表達量差異，采用傳統的諾瑟雜交或者是常規PCR方法，很難將其快速、準確地分析出來，而通過實時熒光定量PCR技術，能夠對植物在不同處理條件下基因的表達量差異進行快速、準確的分析。除此之外，對于抗病基因，還能夠使用多重PCR技術進行檢測。

2005年，李君明等[1]使用多重PCR技術對抗番茄花葉病毒病的Tm 22基因以及番茄抗根結線蟲的Mi基因緊密連鎖的SCAR標記進行擴增篩選，擴增的特異性片段基本完全吻合待引物擴增片段，然后再通過酶切對感病基因型和雜純合基因型進行鑒別。多重PCR技術能夠在同一個PCR反應中同時篩選鑒定兩個抗病基因并早期輔助選育苗期。2012年，陳濤等[2]利用與抗白粉病基因Pm13和Pm21連鎖的特異性標記，將含有抗白粉病基因Pm13和Pm21的114株雜交F4代群體隨機挑選，進行單一PCR和多重PCR技術檢測。檢測結果發現具有Pm21特異標記的有5株，具有Pm13特異標記的有4株，同時具有Pm13和Pm21特異標記的有4株，兩者具有一致的檢測結果。該研究同時表明對于Pm13和Pm21，多重PCR檢測能夠將含有這兩個抗病基因的累加體材料快速、準確地檢測出來。2013年，劉超勤等[3]在對抗根結線蟲病的Mi基因、抗黃化曲葉病毒病的Ty-1和Ty-2基因以及抗葉霉病Cf-5基因緊密連鎖的CAPS標記進行的篩選中，只使用了一次多重PCR技術，然后通過酶切后得到的特異性片段大小與他人的結果基本相同，這表明了多重PCR技術的準確性較高。

3.2 PCR技術在轉基因植物檢測中的應用

轉基因作物面積的增加，雖然解決了人類的溫飽問題，但相應的也帶來了新的問題，比如對人類健康產生的影響等問題。隨著對基因工程認知的逐漸深入，人們對于轉基因食品的安全性也越來越重視，因此就需要對轉基因植物的定量以及定性檢測技術進行加強。PCR定量分析技術能夠在不進行電泳的情況下快速、高效地獲取轉基因成分的準確含量。其中，實時熒光定量PCR技術能夠同時在致病菌以及轉基因農作物中使用，而多重PCR技術在轉基因植物的鑒定中也有著重要的作用。

2002年，Colono等[4]在基于兩對引物的PCR技術中對PAT基因和CryIA基因進行同時檢測，成功地區分出轉基因玉米和非轉基因玉米。2006年，王志純等[5]建立的3種轉基因成分以及馬鈴薯內源PATA基因之間的多重PCR技術，能夠特異性地檢測馬鈴薯及其制品轉基因成分。2009年，王渭霞等[6]采用瓊脂糖凝膠電泳和四重PCR擴增技術對轉基因水稻中Bt、NOS、CpTi以及CaMV35S等常用的外源基因進行了快速準確的檢測；2013年，邱良焱等[7]將轉Bt、Bar基因的雙抗稻米作為原料，采用多重PCR檢測體系對水稻內源基因SPS和外源基因進行設計，之后利用該體系成功地將原料中全部6條目標基因快速檢測出來。

3.3 PCR技術在植物病原物檢測中的應用

對于病原物的分離鑒定是十分困難的，尤其是專性寄生菌，另外病原物的毒性表達與環境條件有著較大的影響。對于病原微生物的檢測，PCR技術是對某一特定的引物進行選擇，然后擴增到相應的DNA片段上。

2010年，譚小勇等[8]建立的三重PCR體系擴增出 615 bp、480 bp 以及 945 bp 的特異性片段能夠對香蕉束頂病毒、黃瓜花葉病毒以及香蕉線條病毒進行同時檢測，且具有快速、準確的優點。而在2011年，趙芹等[9]以番木瓜環斑病毒、小西葫蘆黃花葉病毒以及黃瓜花葉病毒的外殼蛋白基因保守區序列對特異引物進行了設計，然后對單一PCR技術進行優化，建立了同時能夠對3種病毒進行檢測的多重PCR體系，從而能夠快速、準確地對其進行檢測。

3.4 PCR技術在植物育種上的應用

隨著科學技術的不斷發展，PCR技術得到了廣泛的應用，育種學家逐漸將PCR技術運用到植物的育種之中。

2003年，馮翠蓮等[10]對康乃馨ACC氧化酶基因的反義植物表達載體進行了構建，然后將載體通過農桿菌介導法導入到了康乃馨栽培品之中，獲得了3株轉基因植株，然后對其進行PCR-Southern和多重PCR檢測，對康乃馨ACC氧化酶反義基因整合到康乃馨基因組中進行了證實，得到了插瓶壽命得以延長的康乃馨新品種。除此之外，張曉科[11]在2007年使用現有小麥品質形狀基因的分子進行標記，從而建立了3個多重PCR體系，并通過已知形狀的品種對其進行驗證，而其中多重PCR體系Ⅰ能夠運用于一般小麥品質分子的育種，從而使選育材料的整體加工水平得到提高；體系Ⅱ能夠運用于強筋小麥品種的選育；體系Ⅲ能夠運用于糯小麥或者是淀粉品質的選育。對于各個體系之中的引物，其間并不存在錯配以及相互抑制，所以其檢測結果具有可靠性。通過使用這3個多重PCR體系，能夠使小麥品種的評價以及選育的效率得到有效提高。另外，鄭寒等[12]在2009年利用對小麥優質亞基的特異性分子標記構建多重PCR體系，該體系對于這些亞基的鑒定具有成本低、結果可靠等優點。

4 PCR技術在植物生物學研究中的應用前景

采用分子方法對植物進行研究，是近年來植物生物學研究的重要發展階段，而其中，實時熒光定量PCR技術與多重PCR技術較單一PCR技術具有更大的優越性，能夠更為有效、準確地對植物基因進行檢測鑒定，因此已經廣泛地在植物病理檢疫、植物育種以及環境對植物基因的表達影響等方面進行應用。

多重PCR技術是在同一個體系中復合擴增，所以在植物生物學中會存在一定的問題缺陷，比如與非靶序列的結合會產生非特異性擴增或存在多對引物之間的相互抑制等。所以應用多重PCR技術時，應當合理設計引物，對多重PCR體系及其反應條件進行優化從而減少非特異性擴增。除此之外，還有研究者會使用條件完全相同的成熟單一PCR反應，并遵循多重PCR試驗引物組合的一般原則，取得了良好的結果，這就有效避免了多重PCR反應體系建立時繁瑣的優化試驗，也使得多重PCR技術的實際應用范圍得到了極大程度的拓展。

隨著PCR技術的發展，其他技術與PCR技術的結合也逐漸增多，比如將毛細管電泳技術與多重PCR技術相結合，可以使基因分裂效率以及檢測的準確度得到有效的提高；另外四色熒光技術與多重PCR技術的結合能夠使檢測的靈敏度得到提高，同時縮短檢測時間。而隨著科學技術的不斷發展和生物技術的不斷研發，PCR技術也將得到越來越廣泛的應用。