新型冠狀病毒核酸與抗體檢測(cè)影響因素的分析評(píng)價(jià)

劉若錦，李揮，王麗(通信作者)，張秀杰(通信作者)，張曉剛

1 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院 (河北石家莊 050227)；2 英諾特(唐山)生物技術(shù)有限公司 (河北唐山 063000)

新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2)與SARS病毒(SARS-coronavirus，SARS-CoV)有系統(tǒng)相似性。由于SARS-CoV-2的迅速傳播，2019年冠狀病毒已被世界衛(wèi)生組織宣布為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[1]。截至2020年5月5日，全球已記錄有3 517 348例實(shí)驗(yàn)室確診病例和243 401例死亡病例[2]。

由于感染SARS-CoV-2患者的臨床表現(xiàn)從輕微(或無)到包括死亡在內(nèi)的嚴(yán)重體征和癥狀不等[3]，因此，醫(yī)學(xué)專家確診SARS-CoV-2需要高度依賴診斷法[4]。在此，我們簡(jiǎn)要討論SARS-CoV-2的不同檢測(cè)技術(shù)，并重點(diǎn)討論不同檢測(cè)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中出現(xiàn)結(jié)果誤判的可能原因。

1 SARS-CoV-2概述

冠狀病毒是一種包被的無節(jié)段正性RNA病毒，屬于原冠狀病毒亞科。SARS-CoV-2、SARS-CoV和中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome-coronavirus，MERS-CoV)均起源于β型冠狀病毒。雖然一部分人感染新型冠狀病毒的癥狀是輕微的，但其具備潛在的致命性。目前，雖然SARS-CoV-2的病死率(約6.9%)低于SARS-CoV(10%)和MERS-CoV(34%)[2,5-6]，但其傳播率可能高于兩者[7]。澳大利亞國立大學(xué)流行病學(xué)家梅魯·謝爾也表示，很多SARS-CoV-2確診病例只有輕微癥狀，患者表現(xiàn)出來的發(fā)熱、咳嗽等癥狀在流感和其他呼吸道病毒感染中很常見，因此，醫(yī)學(xué)專家確診SARS-CoV-2病例需要高度依賴診斷法[4]。

對(duì)SARS-CoV-2的快速、準(zhǔn)確的診斷有助于公共衛(wèi)生的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)防和有效的管理控制。目前，可檢測(cè)病毒的技術(shù)主要針對(duì)病毒正鏈單股RNA、抗體等[8]。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室和公司開發(fā)了不同類型的SARS-CoV-2的診斷試劑。在我國，截至目前，國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市的包括核酸檢測(cè)試劑和抗體檢測(cè)試劑在內(nèi)的檢測(cè)試劑共30個(gè)。雖然SARS-CoV-2檢測(cè)產(chǎn)品的預(yù)期質(zhì)量與實(shí)際質(zhì)量仍存在差距，但各國政府面對(duì)全球爆發(fā)的局勢(shì)正在努力提高檢測(cè)能力，并且已經(jīng)認(rèn)識(shí)到隨著為控制疫情而采取的對(duì)人群限制措施的解除，檢測(cè)將在今后的病毒控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2 核酸檢測(cè)及其影響因素

2.1 核酸檢測(cè)概述

核酸檢測(cè)是直接對(duì)所采集標(biāo)本中的病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)，用于定性檢測(cè) SARS-CoV-2疑似病例、疑似聚集性病例及其他需要進(jìn)行SARS-CoV-2診斷或鑒別診斷樣本中的核酸；檢測(cè)過程包括標(biāo)本處理、核酸提取、PCR檢測(cè)等步驟，平均檢測(cè)時(shí)間2～3 h；適用于咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液樣本；因其特異性強(qiáng)、靈敏度相對(duì)較高，是當(dāng)前主要的檢測(cè)手段。

目前，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)分為熒光PCR法、恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA捕獲探針法、恒溫?cái)U(kuò)增芯片法和聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法。

2.2 核酸檢測(cè)假陰性的影響因素[9]

2.2.1病原學(xué)

由于SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，容易在傳播過程中發(fā)生變異，且人類對(duì)新型冠狀病毒的研究時(shí)間尚短，因此，當(dāng)病毒RNA的引物設(shè)計(jì)區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，會(huì)直接導(dǎo)致核酸檢測(cè)結(jié)果的假陰性。

2.2.2樣本

(1)采集時(shí)間與類型：《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》中指出，應(yīng)采集患者發(fā)病3 d內(nèi)的標(biāo)本[10]進(jìn)行核酸檢測(cè)，但SARS-CoV-2在人體內(nèi)的潛伏期為2～7 d，很多患者的病程在就診時(shí)已經(jīng)遷延了數(shù)天至數(shù)周，無法確定樣本采集時(shí)是否為檢測(cè)的最佳時(shí)期，亦不能確認(rèn)樣本內(nèi)病毒載量是否仍然處在方法學(xué)的檢測(cè)范圍內(nèi)[11]；此外，不同的樣本類型，陽性率不同，例如鼻拭子優(yōu)于咽拭子[12]，檢測(cè)下呼吸道標(biāo)本的準(zhǔn)確性更高。(2)樣本的質(zhì)量：采集患者的樣本應(yīng)包含病毒，且病毒含量應(yīng)達(dá)到核酸檢測(cè)的下限，影響樣本質(zhì)量的因素包括采樣深度不夠，未成功采集到鼻腔深處含有病毒的細(xì)胞；有的患者鼻甲肥大、鼻道狹窄或者伴有鼻過敏癥狀，難以順利進(jìn)入鼻腔采集樣本；采集過程中可能會(huì)誘發(fā)患者產(chǎn)生分泌物，降低樣本質(zhì)量；未使用專用的病毒核酸采樣拭子與保存液；樣本的保存時(shí)間過長(zhǎng)或者運(yùn)輸中保存溫度過高。

2.2.3人員操作

檢測(cè)人員在核酸提取過程中需要加入病毒裂解液等試劑，操作步驟較多，任一環(huán)節(jié)的操作不當(dāng)，均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2.4儀器設(shè)備

為了保證檢測(cè)儀器、設(shè)備的準(zhǔn)確性及檢測(cè)結(jié)果的精確性，工作人員需定期檢定與維護(hù)相關(guān)設(shè)備。例如，冰箱的溫度會(huì)影響樣本RNA的穩(wěn)定性，移液器的量程不準(zhǔn)確會(huì)導(dǎo)致樣本的加樣誤差。

2.2.5試劑

在檢測(cè)過程中，如果采用了不恰當(dāng)?shù)奶崛≡噭⒋蟠笥绊懖《镜臋z出，因此，核酸擴(kuò)增試劑應(yīng)選擇至少含SARS-CoV-2基因的兩個(gè)位點(diǎn)(開放讀碼框ORF1ab、N基因或E基因)；同時(shí)，還應(yīng)關(guān)注由某些試劑盒引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)欠佳帶來的不利因素，應(yīng)對(duì)其進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 核酸檢測(cè)假陽性的影響因素[9]

檢測(cè)結(jié)果的假陽性主要是由核酸污染、非特異性擴(kuò)增、基線設(shè)置不合理等因素造成的。(1)核酸污染：檢測(cè)中，由于在核酸提取前、提取環(huán)節(jié)、上機(jī)擴(kuò)增期間等過程中均可能造成核酸的污染，因此，核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)獨(dú)立分區(qū)、單向流通，禁止跨區(qū)域操作，同時(shí)，獲取樣本所用的儀器設(shè)備也要避免交叉污染。(2)非特異性擴(kuò)增：主要原因是試劑盒引物設(shè)計(jì)不具備特異性，因此會(huì)形成引物二聚體或引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，進(jìn)而產(chǎn)生非特異性熒光，導(dǎo)致假陽性。(3)基線設(shè)置不合理：設(shè)置基線的作用是扣除擴(kuò)增起始階段的背景熒光信號(hào)，但如果背景信號(hào)過強(qiáng)，軟件可能會(huì)將背景信號(hào)誤認(rèn)為擴(kuò)增信號(hào)，這時(shí)會(huì)導(dǎo)致假陽性。

3 抗體檢測(cè)及其影響因素[13]

3.1 抗體檢測(cè)概述

SARS-CoV-2感染機(jī)體后，最早產(chǎn)生的是IgM抗體，但濃度低、維持時(shí)間短、親和力較低，是急性期感染的診斷指標(biāo)；IgG抗體產(chǎn)生的較晚，但濃度高、維持時(shí)間長(zhǎng)、親和力高，血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染[14-15]。

抗體檢測(cè)包括膠體金法和磁微粒化學(xué)發(fā)光法。(1)膠體金法試劑盒分為檢測(cè)IgM抗體、檢測(cè)并區(qū)分IgM/IgG抗體、檢測(cè)但不區(qū)分IgM/IgG抗體的產(chǎn)品。膠體金法的平均檢測(cè)時(shí)間為15 min左右，無須復(fù)雜設(shè)備，操作便捷，可目視判讀結(jié)果，但其靈敏度一般低于化學(xué)發(fā)光法。(2)磁微粒化學(xué)發(fā)光法分為檢測(cè)總抗體、檢測(cè)IgM抗體、檢測(cè)IgG抗體。該檢測(cè)方法的靈敏度高，操作相對(duì)便捷，一般需要30～60 min。但需要配套的檢測(cè)設(shè)備，臨床推廣受限于設(shè)備的普及程度。

抗體檢測(cè)適用于血清、血漿和靜脈全血樣本，采樣相對(duì)簡(jiǎn)便、樣本更穩(wěn)定。抗體檢測(cè)是對(duì)人體血液中的抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，但在疾病感染早期，由于人體內(nèi)可能還未產(chǎn)生抗體，存在檢測(cè)窗口期，且存在個(gè)體差異，因此，其可用于對(duì)核酸檢測(cè)陰性的病例進(jìn)行輔助診斷及對(duì)病例的排查、篩查，但不能代替核酸檢測(cè)方法，即不能作為新型冠狀病毒感染的肺炎確診和排除的依據(jù)。

3.2 抗體檢測(cè)假陰性

(1)防腐劑和抗凝劑：使用防腐劑、抗凝劑處理后的樣本，會(huì)抑制辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的活性，因此導(dǎo)致假陰性。(2)樣本與試劑的保存：樣本保存時(shí)間過長(zhǎng)，即使在冰箱中，IgG也會(huì)形成多聚體，并且抗體免疫活性會(huì)大大減弱；同時(shí)，試劑未在規(guī)定的條件下儲(chǔ)存也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果[16]。(3)人員操作：人員操作導(dǎo)致的對(duì)使用前試劑在室溫下平衡時(shí)間不足、試劑用量不足、試劑受到污染等，均會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果假陰性。(4)層析速度：層析速度過快，抗原抗體復(fù)合物尚未與檢測(cè)線上的抗體結(jié)合，就會(huì)越出檢測(cè)線，造成假陰性。

3.3 抗體檢測(cè)假陽性[13]

(1)溶血或紅細(xì)胞標(biāo)本：紅細(xì)胞內(nèi)液中的多種酶可與底物發(fā)生非特異性反應(yīng)，且血紅蛋白中亞鐵血紅素可催化底物造成檢測(cè)假陽性[17]；在檢測(cè)區(qū)堆積形成顏色較淺的非特異性條帶也會(huì)干擾目視判定的結(jié)果[18]。(2)纖維蛋白：由于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速過低或離心時(shí)間太短導(dǎo)致血清中的纖維蛋白未能完全析出。(3)細(xì)菌污染：細(xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP，影響結(jié)果判讀[17]；此外，疏水的細(xì)菌碎片可以與金標(biāo)粒子或與捕捉抗體發(fā)生結(jié)合，造成結(jié)果假陽性。(4)患者自身原因：如果患者有某些基礎(chǔ)疾病、存在免疫功能異常或長(zhǎng)期服用某種藥物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生蛋白抗體等自身抗體，可能會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果，造成假陽性[19]。

4 核酸與抗體聯(lián)合檢測(cè)

在感染SARS-CoV-2的不同疾病進(jìn)展階段，依據(jù)核酸、IgM和IgG抗體的不同檢測(cè)結(jié)果，不僅可判定患者所處的感染時(shí)期，還可通過核酸與抗體聯(lián)合檢測(cè)提高診斷效率[13]，更有效地進(jìn)行臨床檢測(cè)和疫情防控。

5 結(jié)語

核酸和抗體檢測(cè)的效率不盡相同，兩者聯(lián)合使用，可取長(zhǎng)補(bǔ)短，不僅可以有效提高SARS-CoV-2的診斷準(zhǔn)確性和時(shí)效性，還能更好地了解病毒載量和疾病進(jìn)展，指導(dǎo)臨床診療工作。但經(jīng)臨床實(shí)踐證實(shí)，SARS-CoV-2的檢測(cè)必須結(jié)合臨床、影像學(xué)、流行病學(xué)資料進(jìn)行綜合分析，才能確診SARS-CoV-2患者，因此，有必要開發(fā)更靈敏和更特異的檢測(cè)技術(shù)和靶向治療方法，以滿足臨床的防控需求。此外，在實(shí)際應(yīng)用過程中，由于不同廠家生產(chǎn)的試劑盒的性能尚無評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，因此，對(duì)試劑盒的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確性等指標(biāo)亟待評(píng)估。