滋陰潛陽養血安神法對室性心律失常大鼠心電圖及Nav1.5電流的影響

鄒飛虎 付玲 梁波 周燕 廖慧玲

摘要：目的? 探討滋陰潛陽養血安神法對室性心律失常大鼠心電圖及對Nav1.5電流的影響。方法? 將健康雄性SD大鼠30只隨機分為模型組、對照組，滋陰潛陽養血安神組，每組10只。模型組給予生理鹽水灌胃，對照組給予美托洛爾灌胃，滋陰潛陽養血安神組給予定悸復脈湯灌胃，灌胃2周后，通過生物機能實驗系統BL-420F記錄心電圖的變化，以100 μmol/L利多卡因為陽性對照，采用全細胞膜片鉗技術測定不同濃度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）定悸復脈湯濃縮液對CHO細胞Nav1.5電流的影響，繪制量效曲線圖并擬合IC50曲線。結果? 模型組室性心律失常發生率為100.00%，滋陰潛陽養血安神組室性心律失常發生率為90.00%，對照組室性心律失常發生率為80.00%。滋陰潛陽養血安神組和對照組心律失常出現時間長于模型組，心律失常持續時間短于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。滋陰潛陽養血安神組和對照組心律失常出現時間、心律失常持續時間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。采用貼壁培養方式，鏡下可見CHO細胞成纖維細胞樣，胞體較小，呈長梭形，為多突的紡錘形或星形的扁平細胞，細胞輪廓清楚，具有突起。100 μmol/L的利多卡因對CHO細胞Nav1.5電流的抑制率為（39.14±3.96）%。不同濃度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸復脈湯濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流均有不同程度的抑制作用，抑制率分別為（48.79±0.65）%、（36.24±0.92）%、（26.95±1.80）%和（21.52±1.65）%，IC50=（24.0±2.4）g/L。結論? 滋陰潛陽養血安神法可推遲室性心律失常出現時間，縮短室性心律失常持續時間，其作用可能與抑制Nav1.5電流有關。

關鍵詞：滋陰潛陽養血安神法;室性心律失常;大鼠;心電圖;Nav1.5電流

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.023

文章編號：1006-1959（2020）01-0072-05

Effect of Ziyin Qianyang Yangxue Anshen Method on Electrocardiogram and Nav1.5 Current

of Ventricular Arrhythmia

ZOU Fei-hu1，FU Ling2，LIANG Bo3，ZHOU Yan3，LIAO Hui-ling3

（1.Department of Cardiology，Tongliang District Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 402560，China;

2.Department of Respiratory Medicine，Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital，Chongqing 400020，China;

3.Southwest Medical University，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract：Objective? To investigate the effects of n Ziyin Qianyang Yangxue Anshen methodon electrocardiogram and Nav1.5 current in ventricular arrhythmia rats. Methods 30 healthy male SD rats were randomly divided into a model group， a control group and a Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group， with 10 rats in each group. The model group was administered with saline， the control group was administered with metoprolol， the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group was administered with Dingji Fumai Decoction， and 2 weeks later， it was recorded by the BL-420F Electrocardiogram changes， 100 μmol/L lidocaine as a positive control， using whole-cell patch-clamp technology to determine different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） of Dingji Fumai Decoction for CHO cells Nav1.5 current effect， draw a dose-response curve and fit the IC50 curve.Results? ?The rate of ventricular arrhythmias in the model group was 100.00%， the rate of ventricular arrhythmias in the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group was 90.00%， and the rate of ventricular arrhythmic rats in the control group It is 80.00%. The arrhythmia occurred longer in the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group and the control group than in the model group， and the arrhythmia duration was shorter than that in the model group，the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the occurrence time and duration of arrhythmia between the Ziyin Qianyang Yangxue Anshen group and the control group （P>0.05）. Adherent culture was used to show that CHO cells were fibroblast-like， with small cell bodies and long spindle-shaped cells. They were spindle-shaped or star-shaped flat cells with multiple protrusions， with clear cell outlines and protrusions. The inhibition rate of 100 μmol / L lidocaine on Nav1.5 current in CHO cells was （39.14±3.96）%. Different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） of Dingji Fumai Decoction can inhibit Nav1.5 current in CHO cells to varying degrees. The inhibitory rates of Dingji Fumai Decoction concentrated liquid of different concentrations （24.0， 8.0， 2.4， 0.8 g/L） on Nav1.5 current in CHO cells were （48.79±0.65）%， （36.24± 0.92）%， （26.95±1.80）% and （21.52±1.65）%， IC50=（24.0 ± 2.4） g/L.Conclusion? The method of? Ziyin Qianyang Yangxue Anshencan delay the occurrence time of ventricular arrhythmia and shorten the duration of ventricular arrhythmia. Its effect may be related to the suppression of Nav1.5 current.

Key words：Ziyin Qianyang Yangxue Anshen method;Ventricular arrhythmia;Rats;Electrocardiogram; Nav1.5 current

室性心律失常（ventricular arrhythmias）包括室性早搏、室性心動過速、心室顫動等，嚴重時可引起心源性猝死，危及生命。中藥能夠多途徑、多環節、多靶點阻斷心律失常的發生，在治療各種室性心律失常的臨床應用中效果顯著。羅玲主任中醫師在臨床實踐中發現，以滋陰潛陽養血安神法指導下形成的定悸復脈湯在抗室性心律失常方面安全有效，且臨床觀察及動物試驗已證實該方的有效性[1，2]，為研究其作用機制，本研究探討滋陰潛陽養血安神法對室性心律失常大鼠心電圖及對Nav1.5電流的影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物? 清潔級健康雄性SD大鼠30只，體重（200±20）g，由西南醫科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（川）2013-17。穩定表達人Nav1.5的中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO），購自HW BioPharma公司。

1.2主要實驗試劑? 定悸復脈湯免煎顆粒由酸棗仁、茯神、川芎、龍骨、牡蠣、桂枝、遠志、大棗、合歡皮、炙甘草十味中藥組成（由四川新綠色藥業科技發展有限公司提供）;定悸復脈湯組成中藥材，由西南醫科大學附屬中醫醫院提供;酒石酸美托洛爾片，由阿斯利康制藥有限公司提供（批號：201701A06，規格：? 25 mg×20片）;氯化鋇，由Alfa Aesar公司提供（批號：T22C006，規格：5 g/支），1% 戊巴比妥鈉。

1.3主要實驗儀器? BL-420F生物信號采集處理系統（成都泰盟科技有限公司生產）。

1.4方法

1.4.1實驗分組及給藥? 將30只健康SD雄性大鼠隨機分為模型組、對照組，滋陰潛陽養血安神組，每組10只。模型組給予生理鹽水灌胃，對照組給予美托洛爾灌胃，滋陰潛陽養血安神組給予定悸復脈湯灌胃，均按2 ml/kg進行，1次/d，連續2周。

1.4.2動物模型制備? 于2周后稱重，并灌胃給藥， 30 min后，予以1%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于木板上。在大鼠四肢內側皮下插入針灸針，連接電極，使用BL-420F生物機能實驗系統記錄心電圖。通過尾靜脈快速推注0.4%氯化鋇4 mg/kg溶液，5 s內推注完畢，記錄心電圖。另通過BL-420F生物機能實驗系統記錄心電圖20 min，分別記錄室性心律失常出現時間及持續時間。

1.4.3定悸復脈湯濃縮藥液制備? 由兩名副主任藥師及以上職稱藥師鑒定為正品。將組成中藥材加入8倍體積量蒸餾水，室溫（20～25℃）下浸泡1 h，煎煮30 min，濾過;濾渣中加入6倍體積量蒸餾水，煎煮30 min，濾過;合并前后2次煎煮后所得濾液，將濾液減壓濃縮后經0.22 μm過濾器過濾后作為濃縮藥液，分裝滅菌后于-80℃凍存備用。實驗時將濃縮藥液進行相應倍數稀釋后獲得實驗終濃度。

1.4.4溶液配制 ①細胞內液（mmol/L）：KCl 40、KF 100、MgCl2、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N′，N′-tetraacetic acid，EGTA）5、HEPES 10。②細胞外液（mmol/L）：NaCl 137、MgCl2 1、KCl 4、Glucose 10、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES] 10、CaCl2 1.8。③胰蛋白酶液：將胰蛋白酶0.25 g和乙二胺四乙酸二鈉（edetate disodium，EDTA-2Na）0.02 g用1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）充分溶解，定容至100 ml，并用0.2 μm的濾器過濾。④陽性對照化合物：選用利多卡因作為實驗陽性對照化合物，將化合物溶解于? 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中配置成100 mmol/L的儲存液，實驗時用細胞外液梯度稀釋后獲得所需終濃度。

1.4.5 CHO細胞的培養及傳代? 穩定表達人Nav1.5的CHO細胞常規培養，傳代在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和400 μg/ml遺傳霉素（G418）的F-12培養基中。于35 mm培養皿每2～3 d傳代1次。在37℃、5% CO2培養箱中放置24 h后用于實驗。

1.4.6全細胞膜片鉗記錄? 將細胞置于培養皿中靜置10 min，貼壁后換用細胞外液進行清洗以除去殘懸浮的細胞碎片。使用PC-10水平拉制儀拉制玻璃微電極，電極入液電阻保持在3～5 MΩ，選用表面光潔、清晰、飽滿、折光性較好、貼壁良好的細胞進行實驗，串聯阻抗（65%左右），采用全細胞膜片鉗技術（吸破式），電壓刺激方案為先將細胞鉗制在-130 mV，然后去極化至-10 mV，持續15 ms，最后恢復至-130 mV;然后選擇電流20%～30%失活時的鉗制電壓進行記錄，電流在細胞外液中至少穩定記錄2 min。給藥（濃縮藥液、陽性對照化合物）均以2 ml/min恒速灌流給藥，灌流給藥后藥物作用達到穩態的判斷標準為電流幅值變化在5%以內。在整個實驗過程中，初始電流要求為1～10 nA，膜電阻應達到或超過1 GΩ，全細胞記錄模式建立后串聯電阻應在5 MΩ以內，漏電流控制在離子通道電流的10%以內。

1.5統計學方法? 使用Clampex 10.5軟件（Axon， USA）記錄Nav1.5電流，結合pCLAMP 10.5軟件（Molecular Devices，USA）和GraphPad Prism7軟件及SPSS 17.0軟件進行數據分析。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行比較，以α=0.05作為檢驗水準，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1三組室性心律失常發生率比較? 模型組室性心律失常發生率為100.00%（10/10），滋陰潛陽養血安神組室性心律失常發生率為90.00%（9/10），對照組室性心律失常發生率為80.00%（8/10）。

2.2三組室性心律失常心電圖指標比較? 滋陰潛陽養血安神組和對照組心律失常出現時間長于模型組，心律失常持續時間短于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。滋陰潛陽養血安神組和對照組心律失常出現時間、心律失常持續時間比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 CHO細胞培養? 采用貼壁培養方式，CHO生長較快，鏡下可見CHO細胞成纖維細胞樣，胞體較小，呈長梭形，為多突的紡錘形或星形的扁平細胞，細胞輪廓清楚，具有突起，見圖1。

2.4陽性對照化合物利多卡因對CHO細胞Nav1.5電流的作用? 100 μmol/L的利多卡因對CHO細胞Nav1.5電流的抑制率為（39.14±3.96）%，具有明顯的抑制作用，見圖2。

2.5不同濃度定悸復脈湯濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流的作用? 不同濃度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸復脈湯濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流均有不同程度的抑制作用，濃度越高，抑制作用越明顯，見圖3。

2.6不同濃度濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流的抑制率及量效? 不同濃度（24.0、8.0、2.4、0.8 g/L）的定悸復脈湯濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流的抑制率分別為（48.79±0.65）%、（36.24±0.92）%、（26.95±1.80）%和（21.52±1.65）%，見圖4A、圖4B。根據不同濃縮藥液濃度繪制量效曲線圖，并通過GraphPad Prism7軟件擬合濃縮藥液對CHO細胞Nav1.5電流的IC50，得IC50=（24.0±2.4）g/L，見圖4C、4D。

3討論

心律失常是激動產生部位和（或）傳導發生異常，以不規則的心搏頻率和心跳節律為特點的心血管系統常見疾病。臨床上約50%的心臟猝死與心律失常相關[3]。室性心律失常所致的心源性猝死每年可導致全球4～5百萬人死亡[4，5]。當心臟發生心律失常時，其離子通道和離子轉運體發生明顯的變化[6]，而離子通道的改變可影響離子流，從而影響心室肌細胞的動作電位時程。

心肌細胞的動作電位和其他興奮細胞一樣，來源于肌細胞的動作電位電導變化形成的跨膜離子流，即膜電流。而膜兩側的電位差和離子濃度差決定離子流的方向和速度，心肌的電生理學特性是由心肌細胞膜的離子如Ca2+、K+和Na+等跨膜移動所決定的[7]。心室肌AP由以下時期組成：0期（快速去極期）、1期（快速復極期）、2期（平臺期）、3期（復極期）和4期（靜息期），其中鈉電流INa參與了0、2、4期。心室肌細胞0期的去極化以INa為主。INa是一種快速內向離子流，80 mV被快速激活（0.5 ms內），大量Na+內流，膜電位迅速去極化，越過0電位形成超射。2、4期與慢失活的INa有關，在其受到激動或INa的失活受阻時，它可以明顯加強，使AP難以復極，動作電位時程APD延長。

鈉通道是選擇性允許Na+跨膜通過的離子通道，主要是電壓門控離子通道，其功能是維持細胞興奮性及其傳導。在心臟，動作電位始于快鈉通道的激活，Na+內流引起動作電位的0期去極化。INa異常會導致一系列的心律失常[8]。鈉通道蛋白1.5亞型（Nav1.5）由SCN5A基因編碼，是心臟組織中存在的主要鈉通道的α亞基，形成了鈉電流流動的主要通道，其在心肌細胞的潤盤、側膜和T管均有表達[9]。Nav1.5通道可與潤盤外Ankyrin-G及縫隙連接蛋白、橋粉蛋白、Caveolin-3等多種蛋白結合，如結合異常，或蛋白表達異常，或發生基因突變，可導致Nav1.5向細胞膜的轉運異常，或鈉通道下調，從而導致鈉電流降低，影響心臟的興奮性，增加傳導障礙和心律失常的易感性，導致心律失常發生。

心律失常臨床主要表現為心慌、胸悶等，屬祖國醫學“心悸”范疇，中醫藥治療室性心律失常目前已成為研究熱點。中藥湯劑針對病因病機治療，療效確切，能夠減輕患者的臨床癥狀，且毒副反應較輕。歷代醫家認為，心悸的發生與體虛勞倦、情志、外邪、飲食等因素有關，病理性質可分為虛與實，虛者不外乎為氣血陰陽虧虛;實證為痰、火、氣、瘀擾動心，因而目前較常見的治法主要為益氣活血、辛溫通陽、清熱化痰安神、疏肝解郁等[10-13]，且發現部分中藥或中藥復方抗心律失常與其作用于離子通道有關[14，15]。羅玲主任認為，心主血脈、心主神志，陰血虧虛、陰不潛陽、血不養心，則心神不寧，正如《丹溪心法》曰：“人之所主者心，心之所養者血，心血一虛，神氣不守，此驚悸之所肇端也。”《古今醫統大全·驚悸門》曰：“治驚悸必先以養心安神之劑，隨后豁痰。”認為治療心律失常應以滋陰潛陽養血安神為主，擬方定悸復脈湯，并在臨床觀察中發現有較好的療效。

定悸復脈湯由酸棗仁、茯神、川芎、龍骨、牡蠣、桂枝、遠志、大棗、合歡皮、炙甘草十味中藥組成，實由酸棗仁湯合龍骨牡蠣湯加減而成。而酸棗仁湯養血安神，龍骨、牡蠣潛陰潛陽，共為君藥;大棗養血，為臣藥;合歡皮安神解郁，為佐藥;炙甘草治“心動悸、脈結代”，為佐使藥;諸藥合用，具有滋陰潛陽，養血安神之功。實驗研究已證實，酸棗仁具有鎮靜，抗心律失常，川芎具有捕獲自由基及Ca2+拮抗作用[16]，灸甘草亦可改善心律失常心電圖[17]。本研究結果表明，以滋陰潛陽，養血安神法為主的定悸復脈湯可推遲氯化鋇模型大鼠室性心律失常出現時間，縮短其室性心律失常持續時間。同時通過采用全細胞膜片鉗技術觀察定悸復脈湯對CHO細胞Nav1.5電流的影響，結果發現定悸復脈湯濃縮液對Nav1.5電流有抑制作用，且隨著濃度的增加，對Nav1.5電流抑制率越大，抑制作用越明顯，CHO細胞Nav1.5電流的時程越長，再次證明定悸復脈湯可抑制Nav1.5電流，延長心肌細胞動作電位的時程，使心率變慢，滋陰潛陽養血安神法抗室性心律失常確切有效。

綜上所述，滋陰潛陽養血安神法可推遲室性心律失常出現時間，縮短室性心律失常持續時間，其作用可能與抑制Nav1.5電流有關。

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收稿日期：2019-09-17;修回日期：2019-11-01

編輯/成森