動物肝硬化模型構建的研究進展

李松，倪德生

(金華市人民醫院肝膽外科，浙江 金華 321000)

肝硬化是肝臟病變的最終結果，其病理變化主要表現為肝細胞的廣泛壞死，殘存肝細胞結節性再生，結締組織增生，形成纖維隔，破壞肝小葉結構，導致假小葉形成，肝臟組織發生變形變硬，最終成為肝硬化。在我國，肝硬化形成較為常見的因素主要是由乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)感染導致的[1-2],一般情況下，肝硬化代償期屬于 Child-Pugh A級，由于肝臟代償功能較強可無明顯癥狀，也可有輕度乏力、腹脹、肝脾輕度腫大、輕度黃疸、肝掌、蜘蛛痣的表現，而肝硬化失代償期則屬于Child-Pugh B C級，以不同程度的肝損害和(或)門靜脈高壓為主要表現，并伴有多系統受累，晚期常出現上消化道出血、肝性腦病(HE) 繼發感染脾功能亢進、腹水、癌變等并發癥，嚴重影響人類健康。目前對于肝硬化的治療包括病因治療、門靜脈高壓及食管胃靜脈曲張(esophageal gastric varices，EGV) 出血的治療、腹水的治療、功能性腎衰竭的治療、感染的治療、肝性腦病的治療。對于失代償期肝硬化，內科常規的保肝和對癥治療不能延長患者生存期，原位肝移植是唯一有效的治療手段，但受供肝缺乏、費用高昂等因素的限制，須嚴格評估肝硬化患者的適應證和禁忌證。所以提倡早發現、早預防、早治療，防止疾病進展對于肝硬化患者尤為重要，這樣可以減少肝硬化患者臨床失代償性并發癥的體現。但目前來說比較艱難的問題還是終末期肝硬化患者，因此尋找有效的方法治療肝硬化十分緊迫。實驗性肝硬化模型的建立始于1938年，以往的多以鼠為主，用以藥敏實驗居多，不適宜手術的干預[3-5]。而大型動物肝硬化的制備又非常困難，因此，建立合適肝硬化模型，能為后續的手術干預創造有利條件，本文就動物肝硬化模型研究進展做一簡要綜述。

1 肝硬化模型

1.1 化學性肝硬化模型

1.1.1 二甲基亞硝胺(DMNA)誘導肝硬化模型 二甲基亞硝胺主要是由肝內氧化酶作用下進行氧化代謝激活，例如N-脫羥基生成甲醛物質，或者產生活性甲基和酚酞烷基亞硝胺。再經過氧化形成甲烷亞硝胺，這些物質對肝臟形成一定的危害，可以導致肝細胞壞死，纖維組織形成，肝臟萎縮，蛋白合成能力下降，肝功能失代償，進一步形成肝硬化。該模型較穩定，與肝炎形成的肝硬化較相似。研究[6-8]顯示用0.5% DMNA溶液2 mL·kg-1(鹽水稀釋)腹腔注射小鼠，每天1次，4周便形成肝硬化，成模率較高，時間較短。有研究者使用上述方法建模[9-13]，發現二甲基亞硝胺不是導致肝臟纖維結締組織沉積而形成肝硬化，而是導致肝臟實質細胞大面積壞死，破壞并改變了肝竇壁的結構，肝臟萎縮，肝功能損害而形成肝纖維化，最終形成肝硬化。DMNA制造肝硬化模型具有以下特點，成功率高、動物死亡率低，而且穩定性較好。由于其過程易形成肝硬化門脈高壓，所以該方法常用于肝硬化門靜脈高壓類動物模型的研究[14-17]。該建模方法是用來研究肝硬化過程中病理生理變化產生的一些組織學變化指標。隨著對該疾病發病機制以及藥物療效的深入研究， DMNA出現一定的弊端，其價格較貴、劑量難以掌握，毒性大易揮發，容易影響周圍的環境和人，再加上用大動物作為研究對象，價格昂貴、管理困難，所以近來運用此種方法制備大動物肝硬化模型較為少見。但考慮DMNA制備肝硬化模型的一些優點，國內外尚有應用DMNA制備大鼠肝硬化模型用于肝硬化機制及篩選抗纖維化藥物的研究報道。

1.1.2 CCl4是由甲烷和氯氣作用產生的一種無色透明的液體，是常用的肝硬化誘導物質，對肝細胞有很強的毒性作用。其作用是溶解肝細胞膜，經肝細胞內質網的細胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝作用下釋放三氯化碳(-CCl3)，進一步經過氧化作用，破壞肝細胞膜、影響蛋白質合成，肝功能損害，肝硬化形成。CCl4建模的原理是其作用于肝臟，導致肝細胞損害的過程中會產生一些炎癥因子和自由基，進一步激活肝星狀細胞(HSC)，產生過多的細胞外基質沉積于肝內導致肝臟纖維化，進一步發展為肝硬化。人類藥物性肝硬化病理特點與其有很多相似之處[18-20]，再加上CCl4誘導動物模型具有以下優點，操作簡便、材料價廉，以及病變典型，所以很多研究者選用該建模方法研究藥物性肝硬化發病機理[21-22]，評估抗肝硬化藥物的藥效。當前的制作肝硬化模型的方法包括，單純 CCl4建模、CCl4聯合苯巴比妥、CCl4聯合乙醇、CCl4復合法等。雖然該方法成模率低、死亡率高，但由于其一定的優點，很多肝硬化相關動物實驗研究還是采用該建模方法。

1.2 酒精性肝硬化模型 酒精主要在肝臟內代謝，代謝過程中會產生許多毒性物質。酒精抑制肝細胞的能量代謝循環，導致脂肪酸合成增加，發生脂肪變，進一步造成肝臟形態和功能的改變，再加上酒精的直接毒害作用，如損傷血管內皮細胞、激活儲脂肪細胞，導致肝細胞的結構和功能損害，進一步導致肝纖維化及肝硬化[23-25]。近年來，隨著國民經濟的飛速發展，居民生活水平提高，酒精性肝硬化的患者逐漸增多，對人類健康構成了一定的威脅。長期過度飲酒可以導致肝硬化。有研究者利用狒狒作為研究對象，成功的制作了酒精性肝硬化模型。該動物與人類結構較相似，所以酒精性肝硬化的發生機制、病理生理改變以及藥物治療多用此模型進行研究，但是狒狒價格較貴，而且不易獲得。Lee等[26]采用長白豬作為研究對象，維持12個月制備肝纖維化模型，時間較長，可見如何縮短造模時間提高造模成功率是此模型今后研究的重點。由于制造模型的時間較長，實驗周期長、造模不穩定，所以這種造模方法多用于酒精造成肝損害機制的研究。

1.3 手術性肝硬化模型 該模型的原理是引起膽管梗阻。具體操作是通過結扎膽總管，使膽汁排除困難，造成肝內膽汁淤積，進一步引起毛細膽管梗阻，匯管區膽管擴張，肝臟纖維組織增生，最終形成肝硬化。有研究者[27-28]利用鼠作為研究對象，手術解剖膽總管予以結扎。該方法一般需要6周，缺點就是死亡率較高，達到30%以上。基于鼠生理結構的特點，此模型應用的比較多，由于鼠缺乏膽囊，所以并發癥的概率較大，因此死亡可能性也增加。膽管結扎后再通，使組織學形成了逆轉。由于此模型血流動力學變化比較突出，所以該模型制造方法常用于研究門靜脈高壓癥血流動力學的改變。

1.4 免疫性肝硬化模型 導致肝細胞損傷的各種因素(化學藥物、酒精、病毒)作用于肝臟，在產生肝細胞損害的過程中，由于物質結合后可獲得抗原性，進一步破壞了機體免疫耐受機制，經過機體免疫產生自身抗體，進一步引發一系列的病理變化，造成肝細胞凋亡，最終形成肝硬化。比如病毒性肝炎，是我國目前最常見的肝硬化病因。由于鼠不易被人類嗜肝細胞病毒感染，用傳統方法造模無法成功，不少研究者近年來開始用嘗試新的技術[29-31]，利用轉基因技術建立此種模型，如肝炎病毒轉基因模型、人類肝嵌合模型是比較常用的方法。由于小鼠的免疫機制對病毒抗原耐受，并不產生損傷肝細胞的沉積物，所以無法觀察到宿主的免疫應答形成機理[32-33]。目前該造模方法用于病毒復制、基因表達等研究。人類肝嵌合模型使小鼠體內高表達尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)，從而激活降纖作用破壞肝細胞。但此種模型免疫缺陷，無法觀察到免疫應答過程。但由于此模型能感染肝炎病毒，所以此方法常用來抗病毒藥物藥效的評估。

1.5 其他性肝硬化模型 血吸蟲蟲卵在肝臟內沉積，導致肝內肉芽腫炎癥及免疫反應，形成可溶性蟲卵抗原，進一步造成肝星狀細胞凋亡，同時激活大量的成纖維細胞，形成大量的膠原纖維，最終形成肝硬化。有研究者注射日本血吸蟲，在第6、8、10周分別形成不同的變化，在匯管區有大量蟲卵，炎癥細胞刺激形成肉芽腫，蟲卵周圍沉積了大量纖維細胞，纖維組織增生；進一步導致肝小葉間膠原纖維沉積，肝小葉結構被破壞導致假小葉形成[34-36]。所以抗血吸蟲的藥物實驗和門靜脈高壓癥的研究常用此模型。

2 模型動物選擇

2.1 小型動物 對于不同的研究目的，小型動物的選擇性較高，目前最常用的小型動物是小鼠。對于肝硬化模型以及其他相關研究來說，小鼠作為研究對象建模具有大量化、多樣化、成熟化的特點[37-38]。但小鼠的體積較小也有一定的弊端，由于血樣本較少，不能同時完善多項指標測定，對于外科微創手術的操作更不適合。目前最重要的是，由于小鼠與人的解剖結構相差甚遠，所以一些疾病發展過程的生理、生化正常值也不盡相同。如果想對小鼠肝硬化模型以及肝硬化引起的門靜脈高壓癥的手術方式進行研究，操作十分不方便，而且小動物模型很難達到預期的效果。

2.2 中型動物 對于外科微創手術介入的研究，小型動物由于體形小的原因，受到很大的限制，尤其是肝臟血管的外科實驗，小型動物建立的手術阻斷肝硬化模型應用就有很大困難。相對于大來說，中等體形動物模型更合適(比如大白兔)。有研究者使用兔作為研究，不但簡便、經濟，而且成功率很高[39-40]，特別對肝性腦病的磁共振波譜、動物肝移植的實驗研究更適用。

2.3 大型動物 利用大動物(猴子、豬、犬等)建立模型，用于觀察外科治療療效相當重要。有研究者利用大型動物建模，制作門靜脈高壓模型[41-42]。因為其飼養簡單容易采集樣本，觀察多項指標方便，而且大型動物肝臟大小適中，取材方便。有研究者用豬作為研究對象，建立豬肝硬化模型。因為豬的結構接近人類，而且對實驗耐受性強、解剖結構清晰、操作方便。也有研究者使用犬運用改良四氯化碳皮下注射法制備犬肝硬化門靜脈高壓癥模型，而猴子由于價格比較貴，較少用于動物實驗研究。

利用動物建模需要合適的方法。因為動物實驗與體外細胞培養不同，動物的解剖特點可以更好地幫助我們研究肝硬化的生物醫學和病理組織學特征[43-44]，幫助我們在復雜的體內多器官系統中觀察各項指標，為開展新的治療措施和測試新的治療藥物提供條件。近期采用不同劑量、不同頻度的CCl4做皮下注射新西蘭大白兔來研究合適濃度四氯化碳建模效果，雖然取得了一定的研究結果，由于動物和人類畢竟存在差異，其發病機制不同于人類，所以實驗中的一些新的發現尚不能直接應用于臨床。

綜上所述，由于動物結構與人類種屬差異，現在沒有出現合適的動物肝硬化模型能夠很好地展現出人的肝硬化特征。但是我們不可否定的是，動物模型給研究者帶來一定益處，它們幫助我們更好地研究疾病發病機制，尋找出新的治療策略。隨著研究的進展，有望尋找一種合適的動物建立有效的動物模型，更好地研究肝硬化發病機制，尋找出肝硬化治療有效藥物，為更好地外科干預提高更好的條件。