葡聚糖在酶催化中的應用進展

杜雪飛,王文君,李雪玉,周 華

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

基于綠色化學和可持續發展的理念,過去20年中生物技術得到了快速的發展[1]。酶是能夠催化復雜化學反應的生物催化劑,具有高活性、高選擇性和高特異性等優良的催化性能,已經在生物技術領域得到了廣泛的應用。為進一步拓寬酶的應用領域,強化酶催化性能,提高酶活性和增加酶催化穩定性已成為近年來生物工程領域的研究熱點[2]。糖是一類重要的化合物,它不只是簡單的能源物質,還是參與生理和病理過程的重要信息分子,同時不同的糖類物質對酶的活性及催化穩定性均有不同程度的保護促進作用,如海藻糖對酶活性的保護作用已進行了較為深入的研究[3]。當前也有將葡聚糖應用于酶催化過程中的相關報道,本文將對葡聚糖在酶固定化和酶催化反應過程中的應用進展進行綜述,分析葡聚糖對酶催化性能的影響因素,為葡聚糖在酶催化中的進一步應用奠定基礎。

1 酶催化應用及存在問題

1.1 酶催化在各領域的應用概況

酶自古以來就被用于食品和飲料產品的生產,如奶酪、啤酒、白酒和醋等傳統食品的制造。隨著生物技術的不斷進步,酶的應用已從食品領域逐漸擴展到醫藥、大宗化學品、日用化學品和環境保護等領域[4]。

1.1.1 酶在醫藥領域的應用 近年來,藥物結構變得越來越復雜,制藥過程的綠色化和環境友好性要求也越來越高,故尋找低成本、安全綠色的生物催化過程來替代傳統的化學催化過程是發展趨勢[5]。Ⅱ型糖尿病治療藥物西格列汀的合成,是近年來酶在制藥工業中的一個重要的成功應用實例,篩選得到節桿菌中轉氨酶用于西格列汀前體的不對稱胺化,成功促使該藥物成為DPP-4抑制劑中的首選藥物[6]。阿托伐他汀是一類通過阻斷肝臟中的膽固醇的合成來降低人體內膽固醇含量的一類藥物[7],開發了兩步法合成三種酶,包括乙酰丙醇脫鹵酶、葡萄糖脫氫酶和還原酮酶,采用多酶級連的方法合成了阿托伐他汀的關鍵中間體羥基腈[8]。與傳統化學法相比不僅減少了成本,還降低了對環境的污染[9]。

1.1.2 酶在食品領域的應用 目前酶技術已經廣泛應用于乳制品、肉制品、飲料果汁、油脂等食品領域中。劉瑩等[10]采用果膠酶、纖維素酶和木聚糖酶制備芒果混汁和蘋果混汁,在降低酶用量的同時,溫和的反應條件更好地保留了水果的營養成分,從而制備出了高出汁率、高營養的果汁。Yang等[11]研究發現,葡萄糖氧化酶與木瓜蛋白酶及木聚糖酶復合使用,能夠催化面團中類胡蘿卜素氧化,從而較好地改善面團褐變現象。隨著人們對于食品安全及品質的日益注重,安全高效的酶制劑越來越受到食品生產者的青睞。

1.1.3 酶在日用化學品制造領域中的應用 相比于傳統日化行業,利用酶來生產日化品不僅能夠降低能耗,還有效減少了環境污染。蛋白酶作為胰腺提取物在洗滌劑中的應用歷史悠久,最新研究[12]開發了能夠在低溫下使用的親冷酶并應用到洗滌劑產品中,親冷酶可在寒冷的環境中使用,其作用過程中不需要加熱,這將有效的節約能源并降低環境壓力。

1.1.4 酶在環境保護領域中的應用 有機農藥的使用和大量的印染廢水已成為當前工業領域最重要的水體污染之一,酶在環境保護領域中的應用已經逐漸受到重視[13]。漆酶能夠催化含有發色基團的化合物如蒽醌、三芳基甲烷、靛青類和偶氮類染料等,因而常被用作生物漂白處理染料廢水[14-15]。康從寶等[16]研究發現白腐漆酶在最適脫色條件下對活性藍(RB亮藍)的脫色率達到了90%,真菌表達的漆酶和氧化還原介體組成的漆酶介質系統,可以將靛藍染料氧化為無色的靛紅染料,并且可以減少用水量及污染物的產生。

1.2 酶催化應用過程中存在的問題

酶雖然能夠在溫和條件下進行催化反應,且具有很高的底物專一性和環境友好特點,然而應用于規模化產品制備過程中的酶來源較窄,空間結構相對柔性易失活,催化穩定性差,客觀上限制了其應用的進一步擴大。因此增強酶的催化性能,提高其操作穩定性是當前酶工程領域研究的熱點課題。

針對酶催化來源較窄的問題,近年來隨著DNA重組和蛋白質工程技術的迅速發展,宏基因組技術、基因挖掘技術和酶的定向進化技術已經逐漸成為新酶篩選和改造的主流技術,已經有越來越多的高性能酶成功運用于酶催化過程中[17]。針對工業生產中酶活性低穩定性差的問題,目前研究主要集中于兩方面:一是基于結構與功能的構效關系,從分子改造的角度進行酶活性改造;二是基于穩定酶催化活性中心的微環境出發[18],采用工程手段對酶的催化活性進行強化,包括酶的固定化、酶催化反應過程的調控等[19]。葡聚糖又被稱為右旋糖苷,是一種由葡萄糖單體組成的以糖苷鍵相連的一種同型多糖[20]。近年來,關于葡聚糖在酶催化性能強化中的研究得到了越來越多的重視,下文將對葡聚糖在酶固定化和酶催化過程中應用展開具體綜述。

2 葡聚糖在酶固定化中的應用

固定化酶是將生物酶鏈接固定到固體載體上,通過固體載體來限制生物酶三維結構變化,從而提高酶的儲存穩定性、熱穩定性(高溫或低溫)、操作穩定性(極端pH或有機溶劑)。同時固定載體的引入使酶可以從反應溶液中較為容易地分離出來,實現了催化劑的重復利用,有效促進了酶在工業生產中的運用[21-22]。

2.1 葡聚糖作為酶交聯劑

酶與載體的連接方式會直接影響到固定化酶的活性的影響。由于空間位阻效應或構象限制,通過共價鍵直接固定化的酶即使固定率較高,但其活性和回收率通常較低。間隔臂的引入在一定程度上解決了這一問題。研究表明[23],通過乙二胺、鹽酸乙二胺、琥珀酸酐和戊二醛等交聯劑的作用,可以使固定化酶的活性回收率得到提高。但活性回收率的改善會受到交聯劑鏈長的限制,由于短鏈交聯劑對酶的交聯限制了酶構象的完整展示,從而影響了酶催化活性的發揮,故利用長鏈交聯劑對酶進行修飾交聯,實現酶的柔性固定,能夠顯著提高固定化酶的催化活性和穩定性。

葡聚糖含有大量的羥基,具有較強的結合水能力,同時葡聚糖具有良好的生物相容性,其結構中含有的羥基可被氧化成醛基用于與酶表面氨基發生特異性反應。以醛基葡聚糖為交聯劑對吸附固定的酶進一步交聯,通過酶分子與葡聚糖在載體內部交聯成網的方法提高固定化酶的結構穩定性。Ren等[24]研究發現,利用中空二氧化硅微球吸附固定脂肪酶CRL,并使用醛基葡聚糖進一步交聯,脂肪酶的加載量線性增加至(171±3.4) mg/g,固定化CRL的熱穩定性和對pH的耐受性均有顯著提高,6次重復使用后剩余活性為82%±2.1%。Cesar等[25]以青霉素G酰化酶、羥腈裂解酶、乙醇脫氫酶和兩種不同的腈酶為原料,用醛基葡聚糖經沉淀和交聯制備交聯酶聚合體(CLEAs),與戊二醛相比,以醛基葡聚糖為交聯劑,酶活性損失顯著降低。牟海霞[26]利用交聯酶聚集體技術,采用醛基葡聚糖作為交聯劑,對腈水合酶進行固定化,獲得腈水合酶交聯酶聚集體,酶活回收率為49.63%。同游離酶相比,固定化酶顯示了有更好的pH、熱穩定性、以及對高濃度底物的耐受性。這些研究表明了葡聚糖作為長鏈交聯劑在酶固定化過程中能夠保證固定化酶構象的完整性有效提高酶的催化活性、穩定性和酶的回收利用率。相比于其它交聯劑,葡聚糖因其良好的生物相容性,多羥基長鏈結構,能夠實現酶的柔性固定等特點,常被優先考慮應用到酶的交聯固定化過程中。

2.2 葡聚糖作為載體修飾劑

固定化酶的活性在一定程度上依賴于固定化載體材料的物理化學特性[27],酶的固定化對載體材料有很高的要求。理想的載體材料應具備良好的機械強度、熱穩定性和化學穩定性、耐生物降解性及對酶的高度親和性、并能保持較高的酶活性等特點[28]。目前有很多研究嘗試從酶固定化載體入手,對載體材料進行修飾以提高酶固定化的效率和穩定性。Goncalves等[29]首先用葡聚糖修飾二氧化硅載體,而后將葡萄糖苷酶固定在二氧化硅載體上,固定化葡聚糖糖苷酶熱穩定性明顯增強。劉瑤[30]用葡聚糖修飾過的磁性微球通過共價結合固定木瓜蛋白酶,研究表明木瓜蛋白酶固定在葡聚糖磁性微球上后,其活性中心沒有受到明顯影響,仍具有催化活性,而且對變性劑的抵抗能力大為提高。雖然目前關于葡聚糖在修飾酶固定化載體的報道相對較少,但這為研究者尋求強化酶催化性能手段提供了一種新的思路。

2.3 葡聚糖作為固定化添加劑

在固定化過程中酶的性能會受到很多因素的影響,如果處理不好,酶的活性、穩定性、選擇性都會降低,可以在固定化過程中加入一些添加劑來保護酶活,使用的添加劑主要有牛血清蛋白、蛋白胨和葡聚糖等多糖類物質等[31-32]。近些年來很多學者嘗試在酶固定化過程中添加一定濃度的糖醇類物質對酶進行保護以提高固定化酶的性能[33-34]。楊小民等[35]研究發現添加葡聚糖的纖維素酶的物理熱變性溫度可以提高到129.6 ℃,紅外譜圖和示差掃描量熱譜圖的結果表明,在高溫下葡聚糖能形成玻璃態,能夠有效地保護酶,并且隨著溫度的提高,葡聚糖和酶分子之間能更好地接觸和混合,從而對酶的保護作用明顯增加。周海燕等[36]以月桂酸與植物甾醇為底物,將葡聚糖與脂肪酶共吸附于大孔樹脂中催化合成植物甾醇酯,考察其催化活性,固定化過程中加入質量7.5%的葡聚糖共吸附固定,酯化率達到了96.2%,比簡單吸附的固定化酶反應時間縮短4 h。在酶的固定化過程中添加葡聚糖等多糖類物質作為保護劑,能夠提高固定化酶的催化活性和對高溫的耐受性,關于葡聚糖作為酶固定化過程中的保護性添加劑其保護性機理還沒有得到科學具體的闡述,但相關研究都表明其作為添加劑對酶催化性能的提高起到了積極地作用。

2.4 葡聚糖作為酶修飾劑

蛋白多糖復合物在工業應用中具有重要意義[37-41]。用聚合物修飾酶蛋白可以顯著提高酶在溶液中的穩定性,可為對冷凍敏感的酶蛋白提供低溫保護。在用多糖對酶進行修飾時,形成額外的分子間和分子內橋可以提高酶的穩定性。其中利用葡聚糖對酶進行修飾是一種正在引起廣泛關注和重視的方法[42],葡聚糖較好的水溶性和生物相容性,有助于維持酶制劑表面微量的水,保持固定化酶的穩定性和催化活性[43]。

Yapaoz等[44]合成了不同摩爾比的脲酶-醛基葡聚糖復合物,比較了該復合物與游離酶在pH、溫度、熱穩定性和貯存穩定性方面的差異,結果表明,在25、80 ℃時,酶活力分別比游離酶高1.4倍和2.5倍,復合物在有機溶劑介質中具有較高的催化活性,同時發現葡聚糖顯著提高了脲酶的熱穩定性和貯存穩定性。李蘇等[45]將醛基葡聚糖連接到漆酶分子上,研究了漆酶在酸性溶液環境中的穩定性是否提高,結果表明通過葡聚糖修飾使得漆酶在pH3、50 ℃下的酶活半衰期從0.07 h提高到17.1 h,在含30%(體積)乙腈、pH3下的酶活半衰期從0.11 h提高到10.3 h。葡聚糖含有大量的羥基,具有較強的結合水的能力,醛基化后的葡聚糖作為修飾劑可與酶表面的氨基基團發生特異性反應,能夠很好地改善酶的穩定性和催化活性。因此利用葡聚糖修飾酶成為目前提高酶催化性能和穩定性的一種有效的手段[46]。

3 葡聚糖在酶催化過程中的應用

3.1 葡聚糖在有機溶劑酶催化體系中的應用

有機溶劑酶催化體系所用的有機溶劑并不是絕對無水的,維持酶空間結構穩定的少量水是必須的[47]。在非水相酶催化反應體系中,當所用有機溶劑極性過強時,有機溶劑會剝奪酶分子表面微環境中的必需水從而使酶失活[48]。有學者研究表明[49],在有機相中加入某些添加劑如聚乙二醇、多元醇等多羥基化合物均可起到穩定酶活性的作用。糖類化合物含有大量的羥基,故在反應體系中加入一些糖類化合物可以很好地維持酶的表面水化作用,改善酶催化的微環境,有力促進酶催化能力的提升。Kajiwara等[50]利用葡聚糖對圓柱形念珠菌脂肪酶進行改性,將賴氨酸殘基與羰基偶聯,通過改變脂肪酶周圍的微環境使酶在有機溶劑中親水性增強;在pH8.0條件下,用葡聚糖改性的脂肪酶在25%(V/V)二甲基亞砜、乙醇、2-丙醇、甲苯和異辛烷中均表現出較高的穩定性。Cabrera等[51]通過離子交換將硫酸葡聚糖覆蓋在脂肪酶CALB分子的表面,或用琥珀酸酐、1-乙基-3-碳二亞胺對酶進行琥珀酰化或氨化,酶在有機溶劑中對扁桃酸甲酯的選擇性加,產物ee值(對映體過量百分數)從83%上升到了90%。葡聚糖在酶催化的有機溶劑反應體系中具有重要的作用,具有多羥基結構的葡聚糖能夠維持酶蛋白表面微環境中的必需水,從而保證了酶在有機溶劑反應體系中活性的穩定。

3.2 葡聚糖在無溶劑酶催化體系中的應用

隨著對酶催化反應體系研究的深入和不同學科之間的交叉,各種新的酶促反應體系也相繼被應用于生產當中,其中無溶劑酶促反應體系是一類重要的非水相體系中酶促反應體系。

無溶劑酶催化反應體系以低熔點底物為反應溶劑,克服了有機溶劑毒性大、易揮發、產物不易分離等缺點,既降低了生產成本,又減少了對環境的污染,是酶催化領域中具有良好發展潛力的綠色環保工藝[52]。Bi等[53]以大孔樹脂為載體,在無溶劑體系中固定化假絲酵母菌脂肪酶(CRL),采用葡聚糖在載體上柔性固定CRL,通過油酸與脂肪醇的酶酯化反應合成了油酸油酯,發現20000 Da葡聚糖固定化脂肪酶的效果最好,最佳反應條件下,酯的收率達到92.6%。無溶劑體系的低成本、低污染等特點使其成為工業生產中一種重要的綠色生產工藝,因而探求高催化效率的無溶劑酶催化體系具有重要的現實意義。目前的報道成功的說明了葡聚糖在無溶劑酶催化體系中的應用得到了認可。未來隨著研究的深入,其應用會更加的廣泛。

4 總結與展望

本文綜述了葡聚糖在酶固定化和催化反應過程中的應用。在酶的固定化過程中,葡聚糖因其含有大量的羥基、較強的水合能力以及良好的生物相容性,可作為酶交聯劑、酶及載體修飾劑用于酶的固定化過程之中,多項研究表明顯著了提高了固定化酶的活性和催化穩定性。同時由于多羥基化合物對酶空間結構的穩定具有保護作用,故將葡聚糖作為保護性添加劑加入到酶的催化反應體系中,尤其是在有機溶劑反應體系中,葡聚糖能夠減弱有機溶劑對酶分子表面微環境必需水的剝奪,有效維持了酶空間結構的穩定、提高了酶的催化性能;在無溶劑酶催化體系中,葡聚糖的添加也明顯促進了酶催化效率的提高,為無溶劑酶催化這一環境友好反應體系的進一步推廣應用奠定了基礎。

雖然近年來葡聚糖在多個酶催化反應實例中得到了成功的應用,但葡聚糖在酶催化性能強化中的作用機理研究仍然存在諸多不足:如葡聚糖的加入如何影響酶的空間結構變化;葡聚糖如何影響酶表面微量水的濃度;不同分子量的葡聚糖對酶結構的穩定作用是否有差異;葡聚糖結構中羥基的醛基化率如何影響酶交聯的效果等,都值得進行深入的研究。隨著相關研究的不斷深入,葡聚糖對酶催化性能強化的機理將會得到進一步的解析,葡聚糖在酶催化中的應用也將不斷增加,為豐富多羥基化合物對酶催化穩定性作用機制的認識作出貢獻。