東北林蛙油研究進(jìn)展

張 傲 張 悅 陳 緣 翁 強(qiáng) 許美玉

北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083

東北林蛙（Rana dybowskii），又稱雪蛤、哈什蟆、田雞，屬于兩棲綱無尾目蛙科林蛙屬中國林蛙種，主要產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林3 省，其中尤以吉林省長白山區(qū)域分布居多，為我國特有的國家二級保護(hù)動物，也是一種珍貴的野生經(jīng)濟(jì)動物[1-2]。由于近年來過度捕捉和自然環(huán)境的破壞，東北林蛙的野生資源正日益減少，已被《中國瀕危動物紅皮書》列為易危（V）物種[3]。雌性東北林蛙冬眠前膨大的輸卵管干制品被稱為林蛙油（oviductus ranae），俗稱蛤蟆油、雪蛤油、哈什蟆油，號稱“綠色軟黃金”，是我國名貴的中藥和傳統(tǒng)的保健食品。林蛙油具有補(bǔ)腎益精、健脾益胃、滋陰補(bǔ)腎、潤肺生津等功效[4]。現(xiàn)代研究還表明，林蛙油具有明顯抗疲勞、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌等保健作用[5-6]。正是由于東北林蛙油的多重藥用和保健功能，其被收錄于《中華人民共和國藥典（2015 版）》。近年來，盡管東北林蛙養(yǎng)殖已成為廣大農(nóng)林水產(chǎn)養(yǎng)殖戶增收致富的手段，但卻始終存在著對野生林蛙珍品進(jìn)行掠奪式捕殺、人工養(yǎng)殖技術(shù)尚未完全成熟、基礎(chǔ)研究和林蛙油利用產(chǎn)業(yè)化發(fā)展不平衡等問題。為了更好地利用東北林蛙資源，提高林蛙油產(chǎn)量以滿足市場需求，亟待需要對林蛙油形成機(jī)制進(jìn)行深入研究。為此，本文擬就東北林蛙油的化學(xué)成分和藥用價值、東北林蛙輸卵管的組織解剖結(jié)構(gòu)、激素與東北林蛙輸卵管膨大的關(guān)系以及目前林蛙油形成機(jī)制研究過程中存在的問題與展望進(jìn)行綜述，期望為進(jìn)一步深入研究林蛙油形成機(jī)制提供參考。

1 林蛙油的化學(xué)成分和藥用價值

東北林蛙油中富含豐富的蛋白質(zhì)，其粗蛋白質(zhì)的含量達(dá)50%以上，且氨基酸種類齊全[7]。同時林蛙油中含有多種微量元素，尤其是鈣、鐵、鋅、鉻含量較高[5]。在林蛙油所含維生素和生理活性物質(zhì)中，以維生素E、雌二醇、睪酮、孕酮和絨毛膜促性腺激素含量較多[8]。林蛙油中不飽和脂肪酸含量較高，占脂肪酸總量的40%左右，其中人體必需脂肪酸亞麻酸和亞油酸含量尤為突出[9]。林蛙油中含有的多種不飽和脂肪酸可以作為前列腺素合成必需的前體，因此具有防止血栓形成的作用[10]。另外，林蛙油中的核酸小分子能夠被皮膚細(xì)胞吸收，使細(xì)胞更新速度加快，能抵抗紫外線傷害，防止皮膚癌變[11]。許會靜等[12]的研究表明林蛙油可調(diào)節(jié)體內(nèi)激素平衡，能夠改善頭暈、乏力等癥狀，具有改善大鼠酒精性肝纖維化的作用。金香男等[13]通過藥理試驗(yàn)證明林蛙油對哮喘模型小鼠具有顯著的鎮(zhèn)咳、祛痰作用。研究還發(fā)現(xiàn)，林蛙油通過減少丙二醛（MDA）和蛋白質(zhì)羰基（PCO）的形成，以及增加總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）的合成發(fā)揮抗氧化的作用。除此之外，林蛙油的蛋白水解物能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和糖酵解，可能是潛在的有效抗腫瘤劑[14]。不僅如此，東北林蛙油還能夠提高機(jī)體的非特異性免疫功能，增強(qiáng)體液免疫功能，促進(jìn)成骨細(xì)胞生長，具有抗骨質(zhì)疏松的作用[15-17]。

2 林蛙輸卵管組織解剖結(jié)構(gòu)研究

林蛙油是林蛙冬眠前膨大的輸卵管組織。目前，關(guān)于東北林蛙輸卵管組織解剖結(jié)構(gòu)的研究主要集中在輸卵管組織形態(tài)學(xué)和顯微結(jié)構(gòu)觀察。在形態(tài)學(xué)方面，黃賀等[18]觀察到東北林蛙輸卵管為一對彎曲的長管，上端細(xì)，下端粗，顏色乳白，具有油質(zhì)光澤，有特殊油脂香氣。翁冀[19]對雌性東北林蛙進(jìn)行解剖研究，發(fā)現(xiàn)東北林蛙輸卵管上端開口于肺泡附近體腔處，下端至泄殖腔；輸卵管管徑較為均一，觸摸有滑膩感，輸卵管的重量、結(jié)構(gòu)形態(tài)具有顯著季節(jié)性變化的特點(diǎn)，即冬眠前的東北林蛙輸卵管重量、管徑等顯著高于包括繁殖期在內(nèi)的其他季節(jié)時期[20]。劉豫寧[21]對東北林蛙輸卵管的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究，發(fā)現(xiàn)黏膜上皮細(xì)胞在輸卵管內(nèi)腔表面排列緊密，存在無纖毛的杯狀細(xì)胞與有纖毛的上皮細(xì)胞；管狀腺呈楔形或橢圓形排列，由腺細(xì)胞組成。腺細(xì)胞呈長方形，直徑為25～75 μm，其細(xì)胞核位于細(xì)胞中間或略偏向細(xì)胞內(nèi)腔一側(cè)[22]。劉豫寧[21]還發(fā)現(xiàn)，東北林蛙輸卵管的顯微結(jié)構(gòu)具有季節(jié)性變化特點(diǎn)。繁殖期東北林蛙輸卵管纖毛發(fā)達(dá)，以纖毛上皮細(xì)胞為主，固有層具有分泌活躍的腺體，在排空的腺體中，腺腔大而明顯。然而，冬眠前期東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞纖毛不發(fā)達(dá)，以杯狀細(xì)胞為主，管狀腺體積增大，腺細(xì)胞核被擠壓在腺細(xì)胞底部，管狀腺開口不清晰，看不到腺腔[21]。在相同顯微倍數(shù)觀察下，冬眠前期的林蛙輸卵管上皮細(xì)胞和固有層腺細(xì)胞體積均顯著大于繁殖期，東北林蛙輸卵管腺細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有較高的增殖與分化，符合在冬眠前期林蛙輸卵管膨大形成林蛙油的實(shí)際情況。

3 激素在東北林蛙輸卵管膨大形成蛙油過程中的作用

3.1 東北林蛙輸卵管中的性激素研究

目前關(guān)于東北林蛙輸卵管中激素成分研究較少，主要集中在性激素的研究上。林蛙油中含有雌二醇、孕酮及雌三醇等甾體類雌激素，其中雌二醇最為常見。國內(nèi)對雌二醇成分的研究也相對較多。李堅(jiān)等[23]利用高效液相色譜法（HPLC）測定了不同產(chǎn)地林蛙油中雌二醇的含量，其中東北林蛙輸卵管中雌二醇的含量為0.301 5 mg/g。王哲等[24]使用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用方法，測得林蛙油中雌二醇含量為52.3±5.8 pg/100 mg，睪酮濃度為52.3±5.89 pg/100 mg，孕酮的含量為9 187.9±19.44 pg/100 mg。翁冀等[19,25]的研究表明，東北林蛙輸卵管中存在雌激素合成酶P450arom 和雌激素及其受體，表明東北林蛙輸卵管自身不僅擁有合成雌激素的能力，而且東北林蛙輸卵管也是雌激素作用的靶細(xì)胞，雌激素能夠通過自分泌或旁分泌對東北林蛙輸卵管發(fā)揮重要作用。

3.2 性激素與林蛙輸卵管膨大形成蛙油的關(guān)系

雌激素作為動物體內(nèi)的一種重要生殖激素，在刺激雌性生殖器官的發(fā)育，維持其功能方面起著重要的作用[26]。P450arom 可以將雄激素芳香化成雌激素，是雌激素合成的關(guān)鍵酶，而雌激素主要通過其2個受體（ERα 和ERβ）介導(dǎo)來發(fā)揮其生物學(xué)作用[27]。研究表明，冬眠前的東北林蛙膨大的輸卵管中的雌二醇含量相對較高[19]，雌激素合成酶P450arom 和雌激素受體ERα 的表達(dá)水平也顯著高于其他季節(jié)時期[25]，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和原癌基因c-kit也在這一時期的林蛙輸卵管組織中具有較高水平的表達(dá)[16]，提示雌激素是直接刺激林蛙輸卵管細(xì)胞增殖、分化成林蛙油的重要因素。另外，有研究表明，冬眠前的林蛙輸卵管脂質(zhì)含量極其豐富。劉豫寧[21]研究發(fā)現(xiàn)，繁殖期東北林蛙輸卵管中的脂聯(lián)素表達(dá)量多于冬眠前期的表達(dá)量，這與脂聯(lián)素和受體相結(jié)合后，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)分解這一觀點(diǎn)是一致的。并且Xi 等[28]的研究也表明瘦素參與調(diào)節(jié)東北林蛙輸卵管發(fā)育的過程，瘦素可能直接作用到輸卵管的黏膜固有層組織上，通過自分泌或旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)東北林蛙輸卵管的發(fā)育。盡管前人在林蛙蛙油中激素的季節(jié)性表達(dá)方面已取得一定的進(jìn)展，但目前對東北林蛙冬眠前期輸卵管特異膨大形成蛙油的分子機(jī)制尚不清楚，調(diào)控東北林蛙輸卵管形成林蛙油的關(guān)鍵基因等方面還存在空白。

4 林蛙輸卵管中的免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)研究

東北林蛙輸卵管中具有豐富的免疫調(diào)節(jié)因子，其中前列腺素（prostaglandin，PG）為比較重要的一類免疫調(diào)節(jié)因子，具有多種生理作用。肖井雷等[29]利用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法，測定林蛙油中前列腺素的含量為0.35%。曹擎[30]通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冬眠前的東北林蛙輸卵管中的前列腺素E2、前列腺素E2 受體EP4 以及環(huán)氧合酶-2均具有較高的表達(dá)，三者的表達(dá)量均高于繁殖期。此外，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）也在東北林蛙輸卵管中被檢測到，提示IL-6 和TNF-α在冬眠前東北林蛙輸卵管的膨大中可能發(fā)揮了作用[31]。另外，在東北林蛙輸卵管中檢測到Toll 樣受體2（TLR2）和Toll 樣受體4（TLR4）有陽性表達(dá)，提示林蛙油的免疫功能是通過TLRs 下游信號通路來調(diào)控，促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖與分化。同時，在東北林蛙輸卵管中還檢測到髓樣分化因子88（MyD88）的較高表達(dá)（高于繁殖期），MyD88 也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，推測MyD88 可能在東北林蛙輸卵管膨大過程中也發(fā)揮作用[31]。

5 林蛙油形成機(jī)制研究過程中發(fā)現(xiàn)的問題與展望

5.1 發(fā)現(xiàn)的問題

1）成本高昂資源稀缺。東北地區(qū)特別是長白山區(qū)域的東北林蛙為藥用的歷史悠久，林蛙油在國際保健食品資源市場上享有盛譽(yù)，價格昂貴，資源極為稀缺。近些年來，由于人為因素導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，部分人為了牟利而大肆捕捉，以至于東北林蛙部分野生品種瀕臨滅絕[32]，現(xiàn)在已經(jīng)被列為國家二級野生保護(hù)動物，這使得對林蛙油研究的成本大大提高，嚴(yán)重阻礙了林蛙油形成機(jī)理的研究。

2）國家對林蛙油相關(guān)研究支持力度不足。林蛙油具有良好的保健功效和豐富的營養(yǎng)成分，其營養(yǎng)和藥用價值正在被逐步發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，具有廣闊的市場前景。但目前國家對林蛙油相關(guān)研究的支持力度卻比較弱。據(jù)統(tǒng)計(jì)，到2018 年為止被國家自然科學(xué)基金委立項(xiàng)的項(xiàng)目中與林蛙研究相關(guān)的只有東北林業(yè)大學(xué)研究的“微生物脅迫下東北林蛙皮膚活性肽選擇性表達(dá)的研究”項(xiàng)目。還沒有出現(xiàn)與林蛙油相關(guān)的研究項(xiàng)目，這也在一定程度上影響了林蛙油形成機(jī)制的研究進(jìn)展。

5.2 展 望

1）林蛙油資源的減少成為推動研究的巨大動力。林蛙油因其顯著的保健功效、豐富的營養(yǎng)成分和藥用價值，具有廣闊的市場前景。然而，隨著生態(tài)環(huán)境的破壞和大肆捕殺，野生林蛙油資源大量減少。與此同時，目前人工養(yǎng)殖的飼養(yǎng)技術(shù)尚不成熟，不能有效解決供需不匹配的問題，不能滿足市場的需要，這與人們對林蛙油越來越大的需求之間存在著巨大的矛盾。因此，開展對林蛙油形成機(jī)制的深入研究，為滿足人們對林蛙油日益增大的需求具有重要意義。

2）新技術(shù)的利用加快林蛙油形成機(jī)制的研究進(jìn)展。近幾年，生物科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，動物源藥的顯著療效引起人們的關(guān)注和重視。酶工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、基因工程技術(shù)以及現(xiàn)代細(xì)胞分離技術(shù)等新技術(shù)、新方法的興起和應(yīng)用為林蛙油形成機(jī)制研究的進(jìn)展創(chuàng)造了新的機(jī)會，能在一定程度上推動對林蛙油形成機(jī)制研究的進(jìn)步。例如，利用全基因組測序及熒光定量技術(shù)等方法，可找到與林蛙油形成相關(guān)的基因。此外，同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)等方法也能為開展林蛙油形成機(jī)制研究提供技術(shù)支撐[33]。隨著生物新技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，林蛙油在臨床、科研、藥用和食品等產(chǎn)業(yè)上將有更加寬廣的應(yīng)用前景。

綜上所述，我國目前對林蛙油形成機(jī)制的研究尚處于初期階段，但隨著人們對林蛙油保健價值認(rèn)識的不斷深入和其經(jīng)濟(jì)效益的不斷提高以及大量新技術(shù)新方法的應(yīng)用，林蛙油形成機(jī)制的研究將會有新的突破，人類會將科研成果迅速轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，更有效地利用東北林蛙資源，挖掘出其潛在價值，進(jìn)而促進(jìn)林蛙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使之帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。