液態奶中乳果糖檢測技術的研究進展

延新宇 鄭百芹 周 鑫

1.河北省唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山063000；2.河北省農產品質量安全檢測技術創新中心，河北唐山063000

乳果糖是新鮮的液態奶經過巴氏殺菌或超高溫瞬時（ultra-high-temperature,UHT）滅菌后，乳糖被異構化，分子中的葡萄糖轉化為果糖而形成的一種雙糖。在液態奶加熱過程中，乳果糖的含量有明顯增加，因此乳果糖是衡量新鮮液態奶熱處理工藝評定的重要指標之一[1]。

1 乳果糖的概念

20 世紀50 年代，Adachi 發現在牛奶加熱過程中，出現了一種合成雙糖，這種雙糖被稱為乳果糖。隨著乳果糖的發現，20 世紀60 年代，Richards 等[2]就在脫脂乳粉中檢測到了乳果糖。隨后，Andrews[3]發現了LA 運轉和Amadori 重排反應是形成乳果糖的主要條件。

乳果糖，又名乳酮糖、半乳糖苷果糖和1-4-β-半乳糖苷果糖，是在堿性條件下，乳糖發生異構化產生的一種雙糖[3]。乳果糖含有一半分子的半乳糖和一半分子的果糖，是乳糖的同分異構體。

乳果糖是一種低熱值、高安全性的還原性二糖，其具有特殊保健功能。乳果糖在消化過程中不能被小腸吸收，進入大腸中被大腸中的雙歧桿菌利用，調整腸道菌的平衡，對雙歧桿菌起到平衡作用[4]；乳果糖可以降低腸道的pH 值，從而抑制有害菌的繁殖，使體內毒素明顯減低；乳果糖被證明具有促進乙肝后肝硬化患者的肝功能恢復和保護腸道黏膜屏障的功能[5]；除此之外，乳果糖還可以用來預防便秘，具有增強身體的免疫力、促進人體對鈣、鎂的吸收等作用。

2 液態奶中乳果糖的檢測方法

由于乳果糖的特殊性，可以將其作為衡量液態奶所經受熱負荷的關鍵指標之一。國內外對乳果糖的檢測有著較高的關注。隨著分析技術的發展，乳果糖的檢測方法越來越簡單、快速和精準。目前乳果糖檢測存在的最主要問題：液態奶中的乳果糖含量較低，在測定時，高含量的乳糖會對其處理過程和最終檢測結果產生影響，因此不同的檢測方法也都提出了各自的解決方法。目前，乳果糖的測量方法較多[6-10]，主要有離子色譜法、MTT 顯色法、微分pH 計法[11]、生物傳感器法、氣相色譜法、安培電流計法、離子交換色譜法、酶解法、高效液相色譜法和傅立葉變換紅外光譜法等。我國的相關標準中乳果糖的測定方法是酶解法（標準NY/T939-2016）[12]，同時國際標準化組織規定測定乳果糖的方法是ISO 酶法。

2.1 酶 法

酶法是目前應用比較廣泛的一種方法。酶法根據酶的添加量和培養溫度可分為ISO 酶法和快速酶法。主要原理是利用β- 半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶將乳糖、乳果糖和葡萄糖水解，可以對測定結果減少干擾。然后再利用相關酶將之前產生的果糖一步步水解成NADPH，再測定NADPH 的吸光值就可以得到乳果糖的含量。快速酶法是黃萌萌等[13]將ISO 酶法中水解乳果糖的培養溫度從40 ℃提高到50 ℃，從而達到快速測定牛乳中乳果糖含量的目的，最終命名為快速酶法。巴氏殺菌乳和新鮮牛乳都可以用快速酶法來檢測乳果糖含量。

利用酶法來檢測液態奶中的乳果糖，其方法檢出限為1 mg/L，可以很準確地進行測量，具有一定的穩定性和可靠性。但是也存在一些缺點，不僅成本高、檢測的時間較長，而且在操作中還容易受到微生物的污染，對檢測結果產生干擾。

2.2 色譜法

1）高效液相色譜法。高效液相色譜法（HPLC）主要是利用沉淀劑將液態奶中的蛋白質和脂肪沉淀，然后再通過高效液相色譜測定乳果糖的含量，應用蒸發光散射檢測器[14]、示差檢測器[15-16]、脈沖安培檢測器等檢測乳果糖的濃度，其中脈沖安培檢測器的靈敏度較高，可以對微量乳果糖進行檢測。劉麗君等[17]利用氨基色譜柱分離、示差檢測器檢測，由于示差檢測器穩定性和靈敏度較低的緣故，無法準確地對乳果糖含量較低的滅菌乳進行測量。液相色譜法一般使用反向柱對乳果糖進行分離測定。由于乳果糖和乳糖是同分異構體，二者保留時間相近，很難加以分離，因此選擇合適的色譜柱、合適的流動相，對液相色譜法檢測乳果糖十分重要。

利用高效液相色譜法來檢測乳果糖，若配置脈沖安培檢測器來測量，其檢測限為0.4 mg/L。高效液相色譜法還可以檢測其他糖類的濃度，在測量乳果糖時也可以很好地避免其他糖類的干擾，得到準確值[18-19]。但是在測量乳果糖過程中，其前處理中蛋白質和脂肪的去除比較繁瑣。

2）氣相色譜法。氣相色譜法主要是將液態奶中的蛋白質和脂肪沉淀，之后進行過濾，使用0.01%苯基-β-D- 葡萄糖溶液作為內標對乳果糖的含量進行測定。氣相色譜法是一種靈敏度高、準確性高且可重復地檢測乳果糖含量的檢測方法，并且也可以對其他糖類進行測量。在檢測碳水化合物時，要先將多糖分解成為單糖，之后將單糖合理衍生，得到易于氣化的物質，再利用氣相色譜儀分析。其靈敏度要比高相液相色譜法高。當用利用氣相色譜檢測乳果糖和分離其他糖類時，一般采用毛細管柱。Montilla 等[20]利用甲烷硅基化糖類的氣體毛細管色譜法對乳果糖進行測定，其結果的精密度較高。之后又利用此方法對多種牛奶樣品進行測定。其結果表示，此方法具有較高的準確性、重復性，并且可以很好地分離乳糖和乳果糖。

利用氣相色譜法來檢測乳果糖，其定量限為50～100 mg/L。但是有報道稱利用毛細管柱，采用特定的溫度梯度，對乳果糖進行測量，其檢測限低至0.50 mg/L。氣相色譜法具有操作簡便、測定周期短的優點，但是液態乳中其他糖類需要合理地進行衍生，從而更好地提高檢測的靈敏度。

3）離子色譜法。離子交換色譜法也是常見的乳果糖檢測方法之一。Tommaso 等[21]采用氫氧化鈉溶液和乙酸鋇作為淋洗液，用陰離子交換分離和脈沖安培檢測方法檢測。該方法存在缺點，易生成碳酸鋇沉淀，柱子的使用壽命和淋洗液的穩定性都受到了影響。2008 年曾文芳等[22]采用了氫氧化鈉和乙酸鈉作為淋洗液，陰陽離子交換分離，該方法可以使淋洗液預處理簡單化，從而得到無毒、價廉的淋洗液。

4）薄層色譜法。薄層色譜法是以薄層吸附劑為固定相，溶劑為流動相，能夠快速分離和定性分析少量物料。朱桂蘭等[23]在2004 年通過薄層色譜儀檢測低聚糖乳果糖，建立了低聚乳果糖的薄層色譜分析法。薄層色譜法具有微量、快速、分離效率高和靈敏度高等優點，但該方法只能作為定性不能作為定量分析。

2.3 其他方法

微分pH 計法也可以對乳果糖的含量進行測定。其主要原理是由于分解葡萄糖和果糖時產生H+，從而利用微分pH 計來測定pH 值，根據pH 值變化來分析出被分解的乳果糖的含量。在實際樣品中，最低pH 值變化可以縮小到0.01 mpH。此外MTT 顯色法也是通過相應的酶水解乳果糖，溶液最后產生帶有顏色的MTT，再利用分光光度計來定量檢測。這些方法雖然測定周期短且靈敏度高，但是由于操作比較繁瑣且處在實驗室研究階段，所以并沒有得到廣泛的推廣。

3 結語

ISO 酶法是目前比較成熟的一種檢測方法，其應用的儀器相對操作簡單，能夠很準確地對乳果糖進行測定；色譜法具有很高的分辨率和準確性，其中高效液相色譜法和氣相色譜法都是發展很高的技術，并且有大量的研究正在對乳果糖進行檢測。其中氣相色譜法的不足之處為需要將乳果糖合理衍生。而相對應用較少的MTT 顯色法和微分pH 計法等方法，這些方法雖然測定周期短且靈敏度高，但是由于操作比較繁瑣，目前還沒有很好地進行普及。就酶法和色譜法而言，酶法比大多數色譜法定量限低且操作簡便，但是其中高效液相色譜法具有很高的分辨率且能準確分離乳果糖和其他糖類。

隨著乳果糖近年來逐漸被重視，對其檢測技術也在不斷探索。目前，國內外對液態奶中乳果糖的檢測技術研究十分關注。雖然針對液態奶中乳果糖含量的檢測方法已有大量研究，但是還沒有一種高效、低成本、操作簡便且抗干擾強的技術出現。因此，建立一種高效、快速、靈敏的檢測技術具有重要意義。